一、神经生长因子对小鼠颈上神经节和大鼠腓神经损伤后修复的影响（论文文献综述）
冯莉娟[1]（2021）在《MicroRNA-21促进糖尿病角膜上皮修复及神经再生的研究》文中指出目的:糖尿病角膜病变（diabetic keratopathy,DK）是糖尿病患者眼部主要的并发症之一,由于糖尿病发病率逐年升高,DK受到越来越多的关注;研究微小RNA 21（micro RNA-21,miR-21）在糖尿病角膜病变中的作用并初步探索其对角膜上皮细胞和三叉神经节细胞的影响,有望为DK的治疗提供新的思路。方法:利用RT-PCR法比较正常小鼠与糖尿病小鼠角膜上皮和三叉神经节组织中miR-21的表达;建立WT与miR-21 KO糖尿病小鼠角膜上皮损伤模型,荧光素钠染色观察角膜损伤上皮修复情况,特异性神经染色评价角膜上皮下神经丛再生情况,应用TUNEL荧光染色法检测角膜上皮及三叉神经节组织的凋亡情况;在小鼠角膜上皮干/祖细胞系（TKE2）中过表达miR-21,同时给予高糖处理,采用划痕试验检测细胞迁移能力,Annexin V/7-AAD双荧光染色检测细胞凋亡;在原代三叉神经节细胞中过表达miR-21,应用免疫荧光法观察三叉神经节细胞轴突的生长及分支,TUNEL染色法检测三叉神经节细胞凋亡。利用转录组测序筛选WT与miR-21 KO糖尿病小鼠角膜上皮及三叉神经节中差异表达的基因,并利用GO对差异表达的基因进行生物功能富集分析;在糖尿病小鼠的结膜下注射miR-21agomir并构建角膜上皮损伤模型,观察角膜上皮损伤恢复及角膜周围神经再生情况,TUNEL荧光染色法检测角膜上皮及三叉神经节组织的凋亡情况。结果:糖尿病小鼠角膜上皮及三叉神经节中的miR-21表达增高,角膜上皮损伤后再生上皮中miR-21表达明显上调,但糖尿病小鼠角膜上皮中miR-21升高幅度低于正常小鼠;miR-21 KO糖尿病小鼠角膜上皮损伤的修复明显慢于WT糖尿病小鼠,角膜神经再生密度小于WT糖尿病小鼠;进一步研究表明,miR-21 KO糖尿病小鼠角膜上皮细胞及三叉神经节凋亡较WT糖尿病小鼠增加。高糖条件下过表达miR-21后,TKE2细胞的迁移能力较对照组明显增加,凋亡减少;原代三叉神经节细胞在体外过表达miR-21后其轴突长度较对照组明显增加,凋亡细胞数较对照组减少,通过转录组测序筛选出497个和554个分别在WT和miR-21 KO糖尿病小鼠角膜上皮组织和三叉神经节组织中差异表达的基因,GO分析显示差异表达基因显着富集的信号通路主要涉及细胞迁移、细胞粘附、细胞增殖与分化、细胞凋亡、以及损伤修复及神经生长等;在糖尿病小鼠结膜下注射miR-21 agomir可以明显加快角膜上皮损伤愈合的过程和促进角膜神经再生。结论:1.角膜上皮损伤导致角膜上皮组织中miR-21的表达增高,但糖尿病小鼠角膜上皮组织中miR-21的升高幅度低于正常小鼠;2.Mi R-21促进角膜上皮细胞迁移、降低高糖诱导的角膜上皮细胞和三叉神经节细胞的凋亡程度以及促进神经生长;3.过表达miR-21可促进糖尿病小鼠角膜上皮损伤修复和角膜周围神经的再生。
常宇鑫[2]（2021）在《AAV-NT3与运动对脊髓损伤后肢体痉挛的干预及新型基因载体AAV-CPP.16的初步构建》文中提出研究背景肢体痉挛是脊髓损伤（SCI）后的最常见的并发症之一,据报道,12%～37%的急性脊髓损伤患者患有肌肉痉挛,而这一比例在慢性脊髓损伤患者中高达65%～78%。尽管严重的痉挛极大地影响了患者的生活质量和脊髓损伤后的恢复,但目前临床上对痉挛的治疗方式仍局限于对症处理。因此,开发一种新的抗痉挛疗法和康复模式,对于脊髓损伤患者的功能恢复和生活质量的提高至关重要。神经营养因子3（NT3）不仅能够降低运动神经元的兴奋性,而且是感觉神经元和运动神经元生存所必需的神经营养因子。研究表明,来自周围肌肉传入信号的输入对于恢复运动功能和重建脊髓损伤段的神经回路至关重要,而这可能是因为周围的肌肉纺锤体合成了NT3。同时,NT3在肌肉中的过度表达会重新平衡兴奋性和抑制性的输入。然而其能否使脊髓损伤后大鼠的脊髓反射正常化尚未得到证实。此外,运动被认为是临床上最简单,最安全,最有效的治疗方法,它能通过平衡感觉的输入和运动的输出来改善运动功能,从而改善患者的生活质量。同时强化训练可使脊髓的本体感受反射正常化。单一的治疗方法可能可以改善某种特定的功能,却无法做到面面俱到,而基于个体化医疗的某些疗法的组合,将预计取得更好的疗效。以病毒为载体的基因治疗能够将治疗基因特异性地输送到病变部位,使其在局部或全身长期稳定的表达,因此目前被广泛应用于中枢系统疾病的诊疗中。其中,腺相关病毒由于其安全、高效的优势被认为是最有希望的基因治疗载体。在众多血清型的AAV载体中,AAV9型腺相关病毒被认为是AAV载体中治疗中枢系统疾病的“标准”载体,但是由于AAV9型腺相关病毒载体穿过血脑屏障的效率仍未能达到预期,导致其治疗中枢系统疾病的效果欠佳。提高病毒的使用剂量或者调整给药途径例如鞘内给药是人们解决上述问题的两种尝试,但是前者会导致体内其他外周器官过大的暴露而产生毒性反应,而后者增加了显着的并发症风险。于是人们将目光聚集到了另外一种可能性的方式——通过对AAV载体的衣壳结构蛋白进行改造,从而改变其转染效率。研究目的构建编码人NT3的重组腺相关病毒（Adeno-associated virus,AAV）,探究编码人NT3的重组腺相关病毒（AAV-NT3）与运动干预相结合的联合疗法对脊髓损伤后肌肉痉挛的保护作用,并探究这种联合疗法减轻痉挛的作用机制,为临床工作中脊髓损伤后肌肉痉挛的防治提供理论基础。此外,构建具有更高传递效率的重组AAV,并探究不同的给药途径其对大脑、脊髓等中枢神经系统的传递效率及对外周组织器官的毒性,为基因治疗在中枢神经系统疾病中的应用起到指导和借鉴意义。研究方法1.编码人NT3的腺相关病毒的构建与验证:将绿色荧光蛋白（f-GFP）、神经营养因子3（NT3）及辅助质粒插入到由人类CMV启动子驱动的AAV载体中,然后通过HEK293细胞包装生产重组AAV。使用Western Blot法检测病毒注射后大鼠后肢肌肉与脊髓背根神经节中NT3蛋白表达的变化。2.AAV-NT3与运动干预对大鼠脊髓损伤后肌肉痉挛的保护作用:通过游泳测试及大鼠后肢肌肉的H反射评价大鼠的痉挛频率,并通过BBB评分评价大鼠的后肢运动功能。3.AAV-NT3与运动干预对大鼠脊髓损伤后肌肉痉挛保护作用的机制研究:运用免疫荧光染色法探究脊髓运动神经元和中间神经元的可塑性变化,并运用Western Blot法检测重组氯化钾协同转运蛋白2（KCC2转运体）的表达。4.新型中枢靶向性基因载体AAV-CPP.16的构建:将多肽序列插入AAV载体的衣壳蛋白基因组进行改造,生产出多种不同的腺相关病毒基因载体,并通过小鼠尾静脉注射和血脑屏障3D体外模型进行筛选。5.新型中枢靶向性基因载体AAV-CPP.16的转导效率:通过静脉注射和侧脑室注射两种主流的中枢神经系统给药途径,探究AAV-CPP.16是否可以在脊髓中高效、稳定地表达,以及其对外周器官的暴露毒性。结果1.成功构建了NT3重组腺相关病毒,并将其成功转染至大鼠体内;相比于对照组与AAV-GFP组,后肢肌肉注射了AAV-NT3的大鼠,其后肢肌肉与脊髓背根神经节（DRG）中NT3的表达水平显着增加。2.游泳测试及H反射的RDD显示AAV-NT3的基因治疗、运动干预及联合治疗均能降低肌肉痉挛的发生频率,但是只有AAV-NT3和联合治疗可以增加后肢BBB评分。3.联合疗法可以明显增加脊髓运动神经元的数量和面积,但是单独的AAVNT3基因疗法不具有此作用;联合治疗可以显着增加脊髓胆碱能中间神经元的面积与GABA能中间神经元的数量;AAV-NT3的基因疗法与联合治疗组脊髓中KCC2的表达显着增加。4.相比于对照组wt AAV9,注射了AAV-CPP.16的小鼠大脑内RFP阳性细胞百分比显着提高,同时在血脑屏障3D体外模型中表达的荧光强度明显增加。5.经静脉及侧脑室给药后,相比于AAV9,AAV-CPP.16在脊髓中绿色荧光蛋白的表达量提高,并且有更高比例的运动神经元与GFP标记的细胞相重合。6.经静脉注射后,相比于AAV9,AAV-CPP.16在脊髓DRG及除肝脏和心脏外的外周组织器官中GFP阳性细胞的比例显着增高;经侧脑室注射后,AAV9与AAV-.CPP.16在外周组织器官中几乎不表达GFP蛋白。结论1.AAV-NT3的基因治疗、运动干预及联合治疗均能减轻损伤后的肌肉痉挛;与单纯的基因治疗或运动干预相比,联合治疗有一定的疗效趋势,但差异并不显着。2.AAV-NT3的基因疗法对运动神经元的作用效果有限,而单纯的运动干预无法改善后肢的运动功能。二者的联合治疗不仅可以通过改变脊髓运动神经元、中间神经元的兴奋性以及增加脊髓内KCC2的含量来减轻脊髓损伤后的肌肉痉挛,也可以显着改善后肢的运动功能。3.相比于wt AAV9,AAV-CPP.16在多种品系小鼠及食蟹猴体内均具有更高的血脑屏障穿透效率和大脑细胞转染效率,并且随着病毒剂量的提升,其效率也随之显着提升。4.经静脉内或侧脑室给药后,相对于AAV9,AAV-CPP.16将基因传递给成年小鼠脊髓及运动神经元的效率均显着提高。5.静脉注射AAV-CPP.16不会带来明显的DRG与肝脏毒性,但是会引起外周组织的大量暴露;而在侧脑室给药途径下,极高传递效率的AAV-CPP.16不会造成明显的DGR毒性,其对外周组织也几乎不具有暴露毒性。
尤荻[3]（2021）在《电刺激联合Cs-Au/GelMA水凝胶对臂丛神经损伤后神经病理性疼痛的疗效及机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景:臂丛神经损伤（brachial plexus injuries,BPI）后可能会遗留不同程度的运动和感觉功能障碍,其中神经节前颈根撕脱伤后会产生严重的神经病理性疼痛。由于同时累及中枢神经系统和周围神经系统,涉及多种复杂的病理生理变化,如神经炎症、胶质细胞活化等,常规的镇痛药物治疗很难获得令人满意的临床疗效。目前临床用于治疗神经病理性疼痛的药物包括非甾体类抗炎药、抗癫痫药、抗抑郁药和类阿片药物,尽管有多种药物可以选择,甚至是联合应用,但临床满意率仍不足一半,而且还要受到不同程度副作用的影响。近年,很多研究人员致力于组织工程学的研究,希望获得更为满意的疗效。水凝胶是由一种可通过非侵入性的方式注入受损部位的组织工程材料,具有良好的生物相容性、生物降解性、可塑性,并通过搭载药物、细胞、纳米粒子等进行局部释放,强化治疗作用,在神经损伤后的功能恢复和神经再生领域具有良好的应用前景。可见光交联的可注射性甲基丙稀酸明胶（methylacrylic acid gelatin,Gel MA）水凝胶,含有精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸序列,对细胞粘附、分化、增殖均具有积极的促进作用,已广泛用于心脏、皮肤、骨骼等多领域的研究中,也被证明可以在脊髓损伤的研究中发挥重要的生理功能。为此,我们拟构建一种基于Gel MA水凝胶的生物支架体系,通过加入壳聚糖（chitosan,Cs）改性的金纳米粒子（Cs-Au NPs）,利用金纳米独特生物学性能,抑制胶质细胞的增殖与分化,抑制促炎症细胞因子的产生,通过抑制神经炎症的水平减轻臂丛神经损伤后的神经病理性疼痛,而且金纳米粒子具有良好的导电性。神经损伤后主要是神经电传导的破坏,而电刺激（electrical stimulation,ES）治疗被报告可以有效改善神经损伤后的神经功能恢复,可以干预神经传导的“闸门变化”,抑制胶质细胞的增殖和活化。综合考虑神经炎症在神经病理性疼痛的发生和发展中的重要作用,我们拟构建一种含有Cs-Au NPs的Gel MA水凝胶,并联合电刺激共同治疗臂丛神经损伤后的神经病理性疼痛。本研究将在4章构建Cs-Au/Gel MA水凝胶,并对其表征进行检测,在第5章通过动物模型检测Cs-Au/Gel MA水凝胶和电刺激对神经病理性疼痛的治疗作用。研究目的:研究BPI后,神经病理性疼痛的发生、发展规律,以及这一过程中胶质细胞、神经炎症水平的变化规律。应用组织工程学手段结合物理治疗——电刺激,治疗BPI后的神经病理性疼痛,构建一种具有潜在导电性能、生物学安全性良好、具有可降解性、亲水性的Cs-Au/Gel MA,选取合适的电刺激频率。分析神经电刺激、Cs-Au/Gel MA水凝胶及其联合应用,对大鼠BPI引起的神经病理性疼痛模型行为学变化、生化改变、细胞学变化的影响,评价其在神经病理性疼痛治疗中的作用及机制,推断其减轻神经病理性疼痛的机制,可能与抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的增殖、活化,降低促炎症细胞因子的产生,抑制神经炎症有关。研究方法:1.选定初始机械性刺激缩足阈值（mechanical withdrawal threshold,MWT）为4g的成年雌性SD大鼠,建立神经节前颈根撕脱伤（preganglionic cervical root avulsion,PCRA）模型（钝性撕脱C6-C8颈神经后根）,研究大鼠臂丛神经损伤后的行为学、细胞学、生化指标变化。2.通过与假手术组进行对比,在损伤后的第1、2、3、5和7天分别测量两组大鼠的MWT和热缩足反射潜伏期（thermal withdrawal latency,TWL）,每次进行行为学检测后,将大鼠处死切取大鼠脊髓组织进行免疫印迹检查,检查指标包括离子钙结合受体分子-1（Ionized calcium binding adaptor molecule 1,Iba-1）、胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein,GFAP）、白介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）、白介素-6（Interleukin-6,IL-6）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNFα）。3.制备Cs-Au/Gel MA水凝胶并进行表征检测,先合成Cs包裹的Cs-Au NPs,再通过细胞实验筛选最适的浓度用于合成Cs-Au/Gel MA水凝胶。4.使用明胶为原材料合成Gel MA水凝胶,并检测其固液转化性能,合成Cs-Au/Gel MA水凝胶检测其亲水性、降解性。5.通过细胞实验筛选最适合的电刺激频率后,应用于动物实验中。6.实验动物随机分为PCRA组（不给予治疗）、ES组（200 Hz电刺激治疗）、Cs-Au/Gel MA水凝胶组（损伤局部注射Cs-Au/Gel MA水凝胶）、联合治疗组（电刺激治疗+水凝胶局部注射）;治疗3日后,处死大鼠后取脊髓组织进行免疫荧光染色,检测星形胶质细胞和小胶质细胞含量,免疫印迹法检测Iba-1、GFAP、IL-1β、IL-6和TNFα含量;免疫荧光染色检测受累节段脊髓组织内脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）含量和超氧化物歧化酶-1（Superoxide dismutase-1,SOD1）、超氧化物歧化酶-2（Superoxide dismutase-2,SOD2）、氮氧化物-2（nitrous oxides-2,NOX2）、氮氧化物-4（nitrous oxides-4,NOX4）等氧化损伤指标;7.连续监测PCRA组、ES组、Cs-Au/Gel MA水凝胶组、联合治疗组大鼠造模后3周的行为学变化——MWT和TWL。研究结果:1.与假手术组比,PCRA模型大鼠术后的MWT和TWL明显降低,过程中可见假手术组虽然术后早期也会出现疼痛敏感,但很快可以自行恢复;而PCRA组术后早期疼痛敏感水平略有改善,但之后一直维持在一个疼痛敏感状态。2.与假手术组相比,PCRA模型鼠的脊髓组织中Iba-1和GFAP的表达均增加,即胶质细胞含量增加;IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌水平也均有升高,即促炎症细胞因子含量增加,并会在损伤后的第2、3日达到高峰,所以后续研究中我们选取术后前3日作为干预治疗的时间窗。3.Cs-Au NPs形态均匀,呈分散分布,浓度为0.05 mg/ml时神经干细胞的增殖情况最佳,并按此浓度制备Cs-Au/Gel MA水凝胶。4.0.05 mg/ml的Cs-Au/Gel MA水凝胶接触角约为81.2°,具有良好的亲水性;在大鼠皮下植入Cs-Au/Gel MA水凝胶后,术后1-5周进行取样发现均无明显的炎症反应、且水凝胶体积逐渐减小,表明其具有良好的生物安全性和可降解性。5.电刺激和Cs-Au/Gel MA水凝胶均可以一定程度上抑制胶质细胞的增生和促炎症细胞因子的产生,但电刺激的作用更为明显,疗效更为显着。损伤后3日,相较于PCRA组,Cs-Au/Gel MA组、ES组、联合治疗组Iba-1表达量均明显减少（P<0.01）;相较于PCRA组,ES组、联合治疗组GFAP表达量均明显减少（P<0.01）;6.相较于PCRA组,三个治疗组中的IL-1β、IL-6和TNF-α均明显下降,并具有统计学差异（P<0.01）。7.电刺激还可以有效抑制BDNF的产生,而Cs-Au/Gel MA水凝胶对氧化损伤抑制作用更为明显。二者的联合治疗,较单独任何一种都更为有效。研究结论:1.PCRA后会出现明显的神经病理性疼痛,且在早期不会自行好转。2.PCRA后大鼠脊髓内星形胶质细胞和小胶质细胞会发生增殖与活化,其中小胶质细胞在疼痛维持的过程中可能更为重要。3.PCRA后大鼠脊髓内IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎细胞因子会增加,其峰值出现在损伤后的48-72 h。4.Cs-Au纳米粒子具有良好的生物相容性,但过高浓度反而可能抑制细胞的增殖。5.Cs-Au/Gel MA水凝胶是一种良好的组织工程支架,具有良好的塑性性、生物相容性、可降解性。6.ES和Cs-Au/Gel MA水凝胶均可抑制PCRA后的胶质细胞增殖与活化、减少促炎症细胞因子的产生、抑制神经病理性疼痛的发生和发展,且二者联合应用疗效可获得进一步的提高。
刘雷[4]（2021）在《二甲双胍对周围神经急性损伤修复作用的机制研究和临床试验研究》文中提出周围神经损伤（peripheral nervous injury,PNI）在临床中十分常见,如何有效的促进损伤后周围神经的修复,缩短修复时间仍是困扰临床医师的难题。人体组织都有一定的损伤后自身修复功能,而周围神经系统自身修复的能力有一些局限性,功能恢复也不尽理想。周围神经的再生速度较慢,这可能会导致其所支配的相关器官的结构和功能的永久性损伤,在再生的轴突重新神经化之前,这些器官可能会导致永久性的不可逆性损伤。如何有效地加速周围神经损伤后的恢复,缩短修复时间,是目前研究的焦点。有研究发现自噬在中枢神经和周围神经损伤中发挥着一定作用。自噬是一种细胞内稳态机制的过程,它通过溶酶体降解细胞受损的细胞器、功能障碍的蛋白质和氧化应激,并循环进入细胞系统。自噬在疾病和正常状态下都有重要作用,如神经变性、饥饿、感染和衰老等。在应激条件下,自噬有助于延长细胞的存活时间。在外周神经损伤过程中,最初不需要的蛋白质、脂质和细胞器在受损处堆积产生应激,从而阻碍了施旺氏细胞（Schwann cells,SC）修复损伤的神经。细胞内的自噬清除过程可以通过清除微环境中的非功能性、不必要的生物分子来消解这些压力,为SC的正常运行和生存提供有利条件。目前通过自噬实现周围神经系统再生的机制还较不明确。二甲双胍是一种降糖药,是治疗II型糖尿病的一线用药,近期报道表明,二甲双胍通过诱导各种神经病理模型系统的自噬来缓解神经病理性疼痛,以及在各种动物模型中,二甲双胍可减少过度磷酸化、聚集蛋白,减少认知能力下降,改善记忆力。二甲双胍可保护神经元免受各种神经毒素的侵害,有助于挽救神经元的神经变性。二甲双胍通过AMPK通路激活,调节细胞存活率,增加线粒体膜电位,使得线粒体生物发生和自噬。因此二甲双胍可能是通过诱导自噬参与周围神经系统的再生修复过程。本课题旨在通过研究二甲双胍在小鼠坐骨神经损伤中诱导的自噬作用是否促进了周围神经损伤后的轴突再生和功能的恢复,探索二甲双胍在加速周围神经恢复中的机制,并在临床上应用二甲双胍联合甲钴胺治疗前臂锐性切割伤,观察其临床疗效以证实二甲双胍促进周围神经损伤后的修复作用。本研究发现:1.二甲双胍治疗小鼠组神经水肿粘连改变明显减轻。术后3个月经CAMP检测显示二甲双胍组潜伏期极显着短于对照组,且神经传导速度和波幅高度明显高于对照组,有统计学意义。二甲双胍组MFS值达到2分和1分所用时间均小于对照组（P<0.05）,有统计学意义。2.二甲双胍诱导自噬在大鼠坐骨神经粉碎性损伤后运动功能和周围神经再生中的作用,通过测量自噬体和二甲双胍治疗小鼠坐骨神经损伤后微管相关蛋白1A/1B-轻链3的表达来检测了这一过程。二甲双胍治疗的坐骨神经受损的小鼠中,自噬作用被上调,死细胞减少。二甲双胍通过MBP和NF200自噬诱导上调,使得运动功能也得到了恢复。3-甲基腺嘌呤（一种自噬抑制剂）降低了神经损伤大鼠的运动再生能力。3.在临床应用中,二甲双胍联合甲钴胺对急性损伤后的前臂周围神经有一定的修复作用,其治疗后的周围神经的动作电位波幅增大及潜伏期明显缩短。治疗6个月后,二甲双胍联合甲钴胺组神经恢复的优良率达80%高于空白对照组的63.3%（P<0.05）,有统计学意义;高于甲钴胺组（73.3%）,但无统计学差异（P>0.05）。且经过临床治疗后,患者术后4周与术后6个月之间电生理呈现一定程度恢复的变化（A组4周和6个月比较,6个月得恢复明显优于4周）;A,C两组比较,A组运动电位的潜伏期和感觉电位波幅均优于维生素C组（P<0.05）;A,B两组比较,差异无明显统计学意义（P>0.05）。A组术前、服用药物4周和6个月后血糖、肝功和肾功无明显差异。本课题探讨了二甲双胍在诱导自噬、神经再生、运动功能恢复、轴突再生、增加再髓鞘化和促进神经传导恢复方面的作用,表明二甲双胍对周围神经的修复及再生提供了良好的营养环境,对周围神经急性损伤的修复起到了积极有效的作用。二甲双胍诱导的自噬在神经再生和运动功能恢复中具有重要的积极作用。本课题进行了临床试验,试验结果进一步证实二甲双胍联合甲钴胺治疗效果有效,且患者治疗前后的血糖、肝功、肾功无明显差异。本课题为解决周围神经损伤的修复这一临床难题提供了新的治疗策略,具有一定的应用前景。第一部分二甲双胍促进小鼠坐骨神经急性损伤修复的实验观察目的:本研究建立了小鼠坐骨神经急性损伤模型,对比两组（二甲双胍治疗组和空白对照组）小鼠术后坐骨神经的大体形态、光镜观察和神经电生理检查。方法:64只小鼠采用随机数字法分为Ⅰ组（二甲双胍治疗组）和Ⅱ组（空白对照组）。所有取左侧大腿处做切口分离坐骨神经,制作坐骨神经损伤模型。治疗组进行二甲双胍（剂量为5mg/kg）的术后治疗,空白对照组进行等量等渗生理盐水注射。分别于术后第1个月和3个月进行取材进行大体和光镜观察。术后3个月对小鼠进行神经电生理检查,并进行运动功能评分。结果:术后3个月大体与光镜下观察:和对照组相比,二甲双胍治疗组神经水肿粘连改变明显减轻。术后3个月经CAMP检测显示Ⅰ组潜伏期极显着短于Ⅱ组,且神经传导速度和波幅高度明显高于Ⅱ组,有统计学意义。Ⅰ组MFS值达到2分和1分所用时间均小于Ⅱ组（P<0.05）,有统计学意义。小结:二甲双胍对周围神经的修复及再生提供了良好的营养环境,对周围神经急性损伤的修复起到了积极有效的作用。二甲双胍对周围神经急性损伤有一定神经营养及修复作用。第二部分二甲双胍诱导自噬促进小鼠坐骨神经恢复的机制研究目的:周围神经损伤（peripheral nervous injury,PNI）在临床中十分常见,如何有效的促进损伤后周围神经的修复,缩短修复时间仍是困扰临床医师的问题。本研究旨在探讨二甲双胍通过诱导自噬促进损伤的小鼠坐骨神经功能恢复的效果。方法:通过电子显微镜、免疫荧光和蛋白质印迹法测定自噬。用足迹强度法研究运动功能恢复情况。用蛋白质印迹法检测轴突的生长和再生,再通过免疫细胞化学分析轴突的再髓鞘化。通过反射性运动功能分析坐骨神经感觉和运动功能恢复情况。结果:本研究揭示了二甲双胍诱导自噬在大鼠坐骨神经粉碎性损伤后运动功能和周围神经再生中的作用,通过测量自噬体和二甲双胍治疗小鼠坐骨神经损伤后微管相关蛋白1A/1B-轻链3的表达来检测了这一过程。二甲双胍治疗的坐骨神经受损的小鼠中,自噬作用被上调,死细胞减少。二甲双胍通过MBP和NF200自噬诱导上调,使得运动功能也得到了恢复。3-MA（一种自噬抑制剂）降低了神经损伤大鼠的运动再生能力。小结:二甲双胍对周围神经急性损伤的修复起到了积极有效的作用。二甲双胍诱导的自噬在神经再生和运动功能恢复中具有重要的修复作用。第三部分二甲双胍联合甲钴胺治疗周围神经损伤的临床研究目的:外伤性周围神经切割伤是手外科急诊常见的损伤形式之一,受损神经部分或完全断裂,需要精细的显微外科缝合,而术后恢复连续性的周围神经需要经历Wallerian变性后神经再生,这个过程需要经历数周时间,而远端的支配肌肉往往会失神经萎缩,如何有效促进神经生长,缩短恢复时间是临床医师面临的问题。本课题通过临床上二甲双胍联合甲钴胺治疗急诊外伤性周围神经切割伤,来观察其临床疗效。方法:2018年10月至2020年10月对90例急诊前臂周围神经急性锐性切割伤患者随机分为3组各30例:A组:术后口服二甲双胍和应用甲钴胺片治疗;B组:术后甲钴胺治疗。C组:空白对照组手术后未服用甲钴胺和二甲双胍。观察三组在运动、感觉功能、神经传导速度的恢复情况以及三组服用二甲双胍后的血糖、肾功、肝功有无差异。结果:二甲双胍联合甲钴胺对急性损伤后的周围神经有促进其恢复的作用,其运动神经动作电位的潜伏期缩短,波幅增大。治疗6个月后,二甲双胍联合甲钴胺组神经恢复的优良率达80%高于空白对照组的63.3%（P<0.05）,有统计学意义;高于甲钴胺组（73.3%）,但无统计学差异（P>0.05）。且经过临床治疗后,患者术后4周与术后6个月之间电生理呈现一定程度恢复的变化（A组4周和6个月比较,6个月得恢复明显优于4周）;A,C两组比较,A组运动电位的潜伏期和感觉电位波幅均优于C组（P<0.05）;A,B两组比较,差异无明显统计学意义（P>0.05）。A组术前、服用药物4周和6个月后血糖、肝功和肾功无明显差异。小结:二甲双胍联合甲钴胺治疗周围神经损伤的效果较满意,是一种安全有效的治疗周围神经急性损伤的方法。
刘振辉[5]（2021）在《仿生导电人工神经支架的研究》文中研究指明目的:（1）制备具有导电功能的多微通道多壁碳纳米管琼脂糖导电支架,并对其进行表征,验证其生物相容性,利用支架进行细胞三维立体培养,研究电刺激对RSC96细胞生长的影响。（2）制备具有取向性纳米纤维的PLLA纤维膜,并对其进行表征,验证其生物相容性,研究纤维取向性对RSC96细胞信号蛋白的影响。（3）制备仿生导电人工神经支架,将支架植入大鼠坐骨神经缺损,探讨仿生导电人工神经支架对大鼠坐骨神经修复效果和机制。方法:（1）利用梯度冷冻和冷冻干燥技术制备出具有多微通道多壁碳纳米管琼脂糖导电支架。通过微结构、溶胀和脱溶涨、导电率、形状记忆功能、载药及药物释放性能、力学性能和生物相容性对制备的多微通道多壁碳纳米管琼脂糖导电支架进行表征,对三维立体培养的RSC96细胞进行组织学评价,观察不同培养条件下细胞生长行为。（2）利用静电纺丝技术制备出具有取向纳米纤维的PLLA纤维膜。通过扫描电镜、力学性能、降解性和生物相容性对制备的PLLA纤维膜进行表征。利用免疫荧光技术研究纤维取向性对RSC96细胞ERK、P38MAPK、MEK和LRP4蛋白的影响。（3）利用定制的模具制备多微通道导电支架,将第二部分制备的高取向PLLA纤维膜和定制的多微通道导电支架组合成仿生导电人工神经支架,并将神经支架植入到大鼠坐骨神经缺损处。将实验动物分为支架组（S）、支架联合电刺激组（S&E）和自体神经移植组（AT）,通过坐骨神经功能指数、神经电生理检测、肌肉组织学检测、再生神经的组织学检测来分析仿生导电神经支架对周围神经再生的影响。结果:（1）加入的多壁碳纳米管没有影响琼脂糖支架的孔隙组成比和形状记忆功能,但0.025%wt多壁碳纳米管提高了支架在溶胀平衡状态下的溶胀率和保水能力。多壁碳纳米管改变了琼脂糖支架的电导率、载药及药物释放能力和力学性能。高浓度多壁碳纳米管对RSC96细胞和PC12细胞的增殖有一定影响。电镜下PC12细胞在多壁碳纳米管琼脂糖支架上生长状态良好。多壁碳纳米管的加入未改变RSCs细胞的S100β表达量。当电刺激存在时,RSC96细胞层沿支架纵轴排列较好,0.025%MWCNT-琼脂糖支架和0.05%MWCNT-琼脂糖支架表现出更好的细胞黏附性。（2）制备的PLLA纤维膜为多孔结构,纤维大部分为取向排列,高取向纤维膜的纤维取向性更高,其表面光滑,粗细均匀,纤维间形成立体的三维孔隙并分布于整个纤维膜。取向PLLA纤维膜的拉伸强度为（59.06±2.49）MPa,取向PLLA纤维膜的拉伸强度为（56.82±2.80）MPa,两种纤维膜拉伸强度没有统计学差异;取向PLLA纤维膜的杨氏模量为（1037.07±133.30）MPa,高取向PLLA纤维膜的杨氏模量为（971.45±112.39）MPa,两种纤维膜杨氏模量没有统计学差异;取向PLLA纤维膜的断裂伸长率为364.48±53.79,高取向PLLA纤维膜的断裂伸长率为356.89±40.21,两种纤维膜断裂伸长率没有统计学差异。增加PLLA纤维膜的取向,并未明显改变纤维膜的拉伸强度、杨氏模量和断裂延伸率。改变纤维膜的纤维取向程度,对PLLA纤维膜的降解速率没有影响。取向PLLA纤维膜和高取向PLLA纤维膜对RSC96细胞的增殖均没有影响。和取向性纤维膜相比,高取向的PLLA纤维膜上的RSC96细胞呈现出现明显的丝状伪足,沿着排列整齐的纳米纤维延伸。和取向性PLLA纤维膜相比,高取向PLLA纤维增加了RSC96细胞ERK、P38 MAPK、MEK和LRP4蛋白表达量（P<0.01）。（3）制备的仿生导电人工神经支架跟大鼠坐骨神经匹配良好,植入神经缺损出未见异物反应。S&E组坐骨神经功能指数、神经电生理结果、肌肉组织学结果、轴突和髓鞘再生效果接近AT组,好于S组。术后12周时免疫组化结果显示,NF-H蛋白和S00-β蛋白表达,S&E组和AT组的高于S组（P<0.01）,而S&E组接近AT组。LRP4蛋白和P38MAPK蛋白表达,AT组高于S组（P<0.01）,但AT和S&E组,S&E组和S组相比均无差异无统计学意义。ERK蛋白和MEK蛋白表达情况,AT组高于S组和S&E组（P<0.01）,S&E组和S组两者相比差异无统计学意义。结论:（1）多壁碳纳米管琼脂糖支架具有高的孔隙率、一定的形状记忆功能、载药及药物释放能力、导电能力,良好的生物相容性。在电刺激存在时,具有导电性能的多壁碳纳米管琼脂糖支架对RSC96细胞生长具有引导作用。（2）和取向性的PLLA纤维膜相比,高取向性的PLLA纤维膜未改变其力学性能、降解性和生物相容性,但增加了ERK、P38 MAPK、MEK和LRP4蛋白的表达量,能引导RSC96细胞生长和迁移,这有利于其在周围神经再生中的应用。（3）仿生导电人工神经支架联合电刺激能够增强周围神经再生。电刺激可能通过ES通过与MAPK信号通路的激活促进周围神经再生,ERK、P38MAPK、MEK和LRP4可能参与周围神经再生。
刘洪雨[6]（2020）在《激活素A参与缺血性脑损伤小胶质细胞极化表型变化的研究》文中提出缺血性脑损伤具有复杂的病理生理过程,涉及多种损伤及修复机制。中枢神经系统中小胶质细胞对所处微环境、不同刺激信号产生差异应答,表现出不同的功能表型M1型、M2型,小胶质细胞这种极化行为在脑缺血损伤中发挥着“双刃剑”的作用,表型的极性可能加重损伤或促进修复。激活素A（activinA,Act A）作为转化生长因子-β（transforminggrowthfactor-β,TGF-β）超家族中成员之一,其受体和结合蛋白广泛分布于脑组织,缺血性脑损伤可引起Act A的表达上调,通过激活不同的信号通路,表现神经保护活性,参与神经元损伤后修复。Act A可能是调控小胶质细胞极化行为的重要因子,但其机制尚不清楚。本研究为探讨缺血性脑损伤小胶质细胞极化规律及Act A参与调节小胶质细胞极化的可能机制,通过体内实验进行大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）建立大鼠局灶性脑缺血损伤模型,体外实验建立小鼠小胶质细胞（BV2）氧糖剥夺/复氧（oxygenand glucose deprivation/repoxygenation,OGD/R）模型,根据缺血/缺氧不同时间点进行分组,检测Act A/Smads信号通路、小胶质细胞表型在缺血性脑损伤中的表达变化,并研究激活素A干预小胶质细胞极化的变化趋势。本研究包括以下内容:1.局灶性缺血性脑损伤中Act A/Smads信号通路的表达变化目的:检测不同缺血时间点Act A/Smads信号通路各位点活化情况。方法:应用Longa线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞模型（MCAO）,选取不同缺血时间点（0d、1d、3d、5 d、7 d及14 d）并进行随机分组,采用改良神经功能缺损严重程度量表（modifiedneurological severity score,mNSS）评价神经功能损伤程度,TTC染色法分析缺血性脑梗死区域体积,HE染色评价梗死后病理变化,实时荧光定量PCR、Western blot法检测脑组织内Act A/Smads通路相关跨膜受体（ActRⅡ）、受体下游因子（Smad2）基因及蛋白的表达水平。结果:MCAO局灶性脑缺血模型建立后,神经功能学评分提示存在明显的功能缺损,随缺血时间延长,评分逐渐降低;TTC染色可见明显的脑梗死病灶,随缺血时间延长,梗死脑组织体积逐渐降低;脑组织冠状位切片HE染色可见皮质梗死核心区大量神经元细胞坏死,细胞核固缩、核仁显示不清;Act A/Smads信号通路中Act A、Act AⅡ型受体及受体复合物中Smad2分别在基因及蛋白水平表达升高,随着缺血时间的延长,在缺血后3-5 d达到表达高峰,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:缺血性脑损伤可诱导Act A表达,上调Act A/Smads信号通路中跨膜受体、受体下游因子基因及蛋白水平的表达,Act A/Smads信号通路参与了缺血性脑损伤过程,缺血3-5 d表达达到高峰,为后续探讨Act A/Smads信号通路与小胶质细胞在缺血性脑损伤中的关系奠定了实验基础。2.局灶性缺血性脑损伤小胶质细胞表型变化研究目的:研究缺血性脑损伤不同缺血时间点小胶质细胞表型变化规律。方法:建立大鼠MCAO模型,选取不同缺血时间点（0d、1 d、3d、5 d、7d及14d）将实验大鼠进行随机分组,实时荧光定量PCR检测M1型小胶质细胞标志物（iNOS、CD86）、M2型小胶质细胞标志物（CD206、Arg-1）基因水平的表达;免疫组织化学法检测M1型标志物（iNOS、CD86）、M2型标志物（CD206、Arg-1）蛋白的原位表达,并计算阳性表达IOD的百分比。结果:实时荧光定量PCR结果显示缺血1 d组M1型小胶质细胞标志物（iNOS、CD86）及M2型小胶质细胞标志物（CD206、Arg-1）mRNA均处于低表达水平,iNOS基因表达水平从MCAO 3d开始逐渐升高,在缺血14d内保持升高的趋势;CD86基因表达水平在MCAO 5 d达到表达高峰后水平逐渐降低,MCAO 14 d时其表达水平接近缺血损伤初期表达水平;M2型小胶质细胞标志物CD206和Arg-1的基因表达趋势相同,二者均在MCAO 1-3 d内表达,在损伤3 d时达到表达高峰,随缺血时间延长,CD206、Arg-1表达水平逐渐降低;免疫组化结果与实时荧光定量PCR结果变化趋势基本一致。与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论:缺血性脑损伤可诱导小胶质细胞的极化,缺血早期以M2型为主,后期以M1型为主,提示了早期缺血诱导的小胶质细胞M2型极化,可能介导吞噬、抗炎作用,而后期M1型极化,可能介导慢性炎症损伤作用。3.Act A对局灶性缺血性脑损伤小胶质细胞表型变化的影响目的:研究Act A对缺血性脑损伤小胶质细胞极化趋势的影响。方法:建立大鼠MCAO模型,选取缺血损伤3d时间点,在MCAO造模6小时后侧脑室微量注射不同浓度的Act A,随机分为假手术组、MCAO 3 d组、MCAO 3 d+Act A2.5 μg/kg 组及 MCAO 3 d+Act A 7.5 μg/kg 组。通过 mNSS 评价神经功能损伤程度,TTC染色法分析缺血性脑梗死区域体积,实时荧光定量PCR检测Act A/Smads信号通路中Smad3、ActRⅡ基因水平、M1型标志物iNOS、M2型标志物CD206基因水平的表达;免疫组织化学法检测M1型标志物iNOS、M2型标志物CD206蛋白的原位表达,并计算阳性表达IOD百分比;结果:mNSS评价缺血性脑损伤后神经功能缺损结果显示Act A干预组评分明显优于MCAO 3 d组,Act A7.5μg/kg组评分优于Act A2.5μg/kg组,组间差异有统计学意义（P<0.05）;TTC染色测定结果显示干预组脑梗死体积明显小于MCAO 3 d组,ActA7.5μg/kg组小于ActA2.5μg/kg组,组间差异有统计学意义（P<0.05）;实时荧光定量PCR结果显示,M1型标志物iNOS基因在MCAO 3 d组表达升高,Act A干预后表达水平降低,MCAO 3 d+Act A 7.5μg/kg 组<MCAO 3 d+Act A 2.5μg/kg 组<MCAO 3 d 组;M2 型标志物 CD 206 基因 MCAO 3 d 组表达高于假手术组,Act A干预后CD206基因表达水平升高,MCAO 3 d+Act A 7.5μg/kg 组>MCAO 3 d+Act A2.5μg/kg 组水平>MCAO 3 d 组;Smad 3、ActR Ⅱ基因表达结果显示干预组水平高于MCAO 3 d组,MCAO 3 d+Act A 7.5μg/kg组高于MCAO 3 d+ActA2.5μg/kg组。差异有统计学意义（P<0.05）。结论:局灶性缺血性脑损伤后不同浓度Act A的干预,可减轻神经功能损伤程度、缩小脑梗死体积,促进Act A/Smads信号通路的表达,上调M2型标志物CD206的表达,下调表M1型标志物iNOS的表达,效应与干预浓度具有正相关性。Act A/Smads信号通路的活化可诱导小胶质细胞表型从M1型向M2型转化,这种变化可能发挥抗缺血损伤作用,为缺血性脑损伤的治疗提供潜在的转化靶点。4.Act A对小胶质细胞体外OGD/R过程中M1、M2型表达的影响目的:研究小鼠小胶质细胞BV2细胞OGD/R过程中不同时间点M1、M2型标志物、信号通路关键靶点的表达情况及Act A干预对M1、M2型表达的影响。方法:BV2细胞复苏后常规培养（高糖DMEM培养基,37℃、5%CO2）传代至第3代,通过更换无糖DMEM培养基、三气培养箱低氧培养（94%N2、5%CO2、1%O2）,建立BV2细胞氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型,将细胞分为对照组、OGD 1 h/R0h、OGD 1 h/R3 h、OGD 1 h/R6h、OGD 1h/R12h五组,Western blot对M1型标志物iNOS、M2型标志物IL-10及Act A/Smads信号通路Smad2蛋白表达水平进行检测;选择OGD1 h/R6h时间点,给予不同浓度Act A预培养BV2 细胞,分为对照组、OGD 1h/R6h 组、OGD 1h/R6h+Act A30nM组及OGD 1 h/R6h+Act A30nM组共四组,进一步Western blot检测各组M1型标志物iNOS、M2型标志物IL-10的表达情况及Smad2蛋白水平的表达情况。结果:体外实验成功培养BV2细胞并建立BV2细胞OGD/R模型,WesterBlot结果显示随复氧时间的延长,Act A/Smads信号通路Smad2蛋白表达逐渐增加,M1型标志物iNOS蛋白表达逐渐增加,M2型标志物IL-10蛋白表达逐渐增加,与R6 h达到高峰后表达水平有所回落;Act A预处理BV2小胶质细胞后,与OGD 1h/R 6 h组比较干预组Smad2蛋白表达逐渐增加,OGD 1 h/R 6 h+Act A50nM组高于OGD 1 h/R 6 h+Act A30nM组;M1型标志物iNOS蛋白表达干预组低于OGD 1 h/R 6 h 组,OGD 1 h/R 6 h+Act A50nM 组低于 OGD 1 h/R 6 h+Act A30nM组;M2型标志物蛋白水平表达逐渐升高,干预组高于OGD 1 h/R6 h组,OGD 1 h/R 6 h+Act A50nM 组高于 OGD 1 h/R 6 h+Act A30nM 组。结论:Act A可通过上调Act A/Smads信号通路中下游因子Smad2蛋白水平的表达,从而发挥神经保护作用,这一过程也参与调控了氧糖剥夺条件下BV2细胞极化过程,提示了 Act A/Smads信号通路可能通过调控小胶质细胞表型变化从而影响神经元细胞在缺血性损伤中的转归。
汪瑶[7]（2020）在《基于基因组学探究AKBA对大鼠坐骨神经损伤的修复机制》文中研究说明近年来,随着小动物临床医学的快速发展,小动物周围神经损伤的病例逐年增多,周围神经损伤治疗已成为兽医师关注的焦点。因此,寻找开发治疗周围神经受损后的修复药物成为小动物临床的迫切需求。本试验以活血化瘀药乳香的活性成分11-羰基-β-乙酰乳香酸（acetyl-11-keto-β-boswellicacid,AKBA）为试验药物,研究其对坐骨神经损伤的修复作用,为今后开发小动物周围神经损伤治疗药物提供新的思路和方法。试验选取180～220 g雄性SD大鼠,随机分为空白组、假手术组、模型对照组、AKBA用药组以及甲钴胺对照组。空白组,未对大鼠做任何处理;假手术组,采用外科手术暴露大鼠坐骨神经,但对坐骨神经不做任何处理;其他三组均采用外科手术,暴露坐骨神经,利用血管钳挤压坐骨神经,制作坐骨神经损伤模型。试验给药采取灌胃的方式,分别对空白组（生理盐水）、假手术组（生理盐水）、模型对照组（生理盐水）、AKBA用药组（10mg/kg）、甲钴胺对照组（1 mg/kg）,给药30 d。于试验开始的第10 d、20 d和30 d进行坐骨神经功能指数（sciatic functional index,SFI）的检测和脚趾夹捏测试。第30 d,将所有大鼠剖杀、取样,透射电镜观察其坐骨神经髓鞘损伤修复情况;罗克沙尔固蓝（Luxol fast blue,LFB）染色髓鞘,镀银染色神经纤维,观察其损伤修复;免疫组化法检测髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein,MBP）和神经元III类β微管蛋白（β3Tubulin,Tuj1）;利用二代基因测序技术对损伤的坐骨神经进行全转录组基因检测,采用Fast QC软件分析测序得到的原始测序序列,Trim Galore方法对raw reads检测到的数据进行过滤,HISAT2软件将过滤后得到的clean reads与大鼠基因组数据库进行比对。差异基因筛选采用Cuffdiff软件并采用2种标准进行差异基因的筛选。采用实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time Quantitative polymerase chain reaction,q RTPCR）技术和免疫印迹（Western blot,WB）技术对基因组学结果进行验证,进而明确AKBA用药组大鼠坐骨神经损伤修复的相关机制。结果:大鼠坐骨神经功能指数显示,AKBA用药组和甲钴胺对照组坐骨神经功能逐渐恢复,但模型对照组坐骨神经功能恢复较差。脚趾夹捏痛觉试验结果显示AKBA用药组和甲钴胺对照组大鼠疼痛反应在第10 d、20 d和30 d均高于模型对照组。透射电镜结果显示,AKBA用药组和甲钴胺对照组与模型对照组相比,髓鞘数目明显增多,排列致密。坐骨神经的LFB染色显示,模型对照组有大量髓鞘溶解,形成大量脂质空泡,髓鞘形状不一,较空白组数目减少;AKBA用药组和甲钴胺对照组髓鞘形状规则,数量丰富,无脂质空泡。坐骨神经的镀银染色结果显示,模型对照组的神经纤维不完整,神经轴突紊乱,厚度不均且在断端处包含更多的分离轴突;而AKBA用药组和甲钴胺组神经纤维完整,神经轴突厚度均匀。MBP的免疫组化结果显示:与模型对照组相比,空白组、假手术组和AKBA用药组的MBP表达水平极显着增加（P<0.01）,而甲钴胺对照组的MBP表达水平显着增加（P<0.05）。β3Tubulin的免疫组化结果显示:与模型对照组相比,空白组和AKBA用药组的β3Tubulin表达水平极显着增加（P<0.01）,而假手术组的β3Tubulin水平表达显着增加（P<0.05）。基因组学结果显示:模型对照组与AKBA用药组相比上调基因189个,下调基因69个;AKBA用药组与假手术组相比上调基因194个,下调基因161个,模型对照组与假手术组相比上调基因171个,下调239个。对比这些差异表达基因在基因本体论（Gene Ontology,GO）分析中,AKBA用药组与假手术组GO分析中,AKBA用药组在生物进程（Biological process,BP）占的比重最重,为最主要的分类项;而AKBA用药组与模型对照组,假手术组与模型对照组分别的GO分析中,也是BP占的比重大,差异基因在它的表达中最多。在京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路分析中,AKBA用药组与模型对照组差异表达基因富集最多的通路是吞噬作用这一通路。神经生长因子信号通路中也有2个重要的基因发挥作用,分别是脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）和神经生长因子受体（Nerve growth factor receptor,NGFR）。根据基因组学的结果对坐骨神经损伤后相关的基因BDNF、NGFR、神经生长因子（Nerve growth factor,NGF）及其吞噬途径中髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）进行q RTPCR验证,结果显示:与模型对照组相比,AKBA用药组及甲钴胺对照组的NGFR、NGF、BDNF基因表达水平显着增加（P<0.01）,而与模型对照组相比,AKBA用药组和甲钴胺对照组的MPO基因表达水平显着减少（P<0.01）。同时对这几个基因的蛋白水平也进行的检测,结果显示:与模型对照组相比,AKBA用药组在BDNF、NGFR、NGF的蛋白含量显着升高（P<0.05或P<0.01）,MPO蛋白含量显着降低（P<0.01）。结论:AKBA促进大鼠损伤坐骨神经运动功能和感觉功能的恢复,加速神经纤维、髓鞘损伤的修复。AKBA能够提高神经营养因子途径中的BDNF,NGFR,NGF的基因表达和蛋白的含量,也能够降低调控吞噬途径信号通路中的MPO的蛋白含量,促进大鼠坐骨神经损伤的修复。
李文迁[8]（2020）在《SIRT3通过调控小胶质细胞分化和凋亡改善慢性神经病理性疼痛中枢炎症的机制研究》文中进行了进一步梳理慢性神经病理性疼痛是中枢神经系统内环境稳态失衡的结果,即使在撤除原发致痛诱因后仍迁延不愈。典型的神经病理性疼痛由外周神经损伤发展形成,持续时间长且难以根治,严重影响患者的生活质量。小胶质细胞是中枢神经系统常驻巨噬细胞,通过表型分化异质性发挥着“促炎”和“抗炎”的双重功能,维护中枢炎症的稳态。坐骨神经慢性压迫损伤（chronic constriction injury,CCI）是应用最为广泛的神经病理性疼痛动物模型之一。本研究通过基因富集分析筛选小鼠在CCI疼痛慢性化过程中的差异基因集,再根据主要差异基因集间的相关性确定研究对象。SIRT3是端粒保护蛋白Sirtuins家族成员之一,特异性定位于线粒体且参与调节线粒体能量代谢和蛋白乙酰化水平,与细胞生存和死亡、线粒体代谢、免疫和炎症以及昼夜节律等基本生物功能息息相关;SIRT3属于III类组蛋白去乙酰化酶,通过降低活性氧簇、激活超氧化物歧化酶和过氧化氢酶,保护线粒体免受DNA损伤和氧化应激诱导的细胞死亡。蛋白质印迹法和免疫组化结果显示,SIRT3蛋白在小鼠大脑皮层、脊髓背角和背根神经节中的基础表达量较低,而在CCI痛觉敏化发生早期表达增高,随着慢性疼痛的发展SIRT3蛋白表达量逐渐减少。在CCI痛阈值测试中,Sirt3基因敲除(Sirt3-/-)小鼠的异常性疼痛和痛觉过敏症状明显比野生型(Sirt3+/+)小鼠更为严重,且疼痛程度的加剧在CCI后期更显着。Sirt3-/-小鼠大脑中促炎细胞因子TNFα的转录水平也显着高于野生型小鼠。本研究体系中CCI诱导的慢性疼痛使小胶质细胞大量增殖并发生形态学改变。在疼痛相关脑区,Sirt3-/-小鼠的小胶质细胞数量要高于野生型小鼠;然而就CCI引起的小胶质细胞相对增殖量而言,Sirt3-/-小鼠却比野生型小鼠更少。通过流式细胞分析,下调Sirt3基因能够抑制小胶质细胞“抗炎”表型,使M2型标记物CD206降低、“促炎”的M1型标记物CD45、CD68和CD86增高。挑选出Sirt3-/-小鼠和Sirt3+/+小鼠在CCI术后发生慢性神经病理性疼痛者,取其脑组织进行基因富集分析,将Sirt3-/-小鼠和Sirt3+/+小鼠脑组织间的差异基因集比对KEGG信号通路数据库,发现SIRT3改善慢性神经病理性疼痛相关症状和神经炎症的转归可能与细胞因子受体、烟酰胺类代谢、肿瘤坏死因子信号通路、趋化因子信号通路和JAK/STAT信号通路密切相关。通过蛋白质印迹法定量分析,CCI发病过程中小鼠大脑中p-STAT1（磷酸化的STAT1）、p-STAT3、p-STAT6和p-P65（NF-κB）的变化趋势均类似于SIRT3,即在疼痛急性期增高,在疼痛慢性化过程中降低。在原代培养的Sirt3-/-小鼠的小胶质细胞中,p-JAK1、p-STAT1、p-P65在“促炎”（INFγ/LPS）或“抗炎”（IL-4）介质的刺激下都明显增高。小干扰RNA（small interfering RNA,si RNA）沉默HMC3小胶质细胞的Sirt3基因后,p-JAK1在促炎刺激下亦明显增高。相反,Sirt3-/-原代小胶质细胞中p-STAT6在IL-4刺激下明显降低,p-STAT3不受IL-4或IFNγ的影响而在LPS（脂多糖为小胶质细胞激动剂）刺激下明显降低。精氨酸酶1（Arginase-1,Arg-1,M2型小胶质细胞标记物）在Sirt3-/-小胶质细胞中表达也明显降低。免疫共沉淀实验结果表明SIRT3与STAT1或STAT3存在相互作用,SIRT3对STAT1和STAT3产生依赖于酶活性的去乙酰化修饰。STAT1和NF-κB-P65磷酸化激活后能够转录调控下游的促炎相关基因。而SIRT3的过表达恰能抑制p STAT1和p P65。相反,SIRT3的过表达使p STAT3增高,有利于调控下游的抗炎相关基因转录。rt/q PCR定量分析了小胶质细胞不同表型的相关炎症因子和趋化因子,发现Sirt3-/-小鼠的原代小胶质细胞在特定刺激下,TNF-α、i NOS、IL-6、CX3CL1和CXCL11等促炎介质的转录增加而抗炎性细胞因子IL-10转录减少,表明SIRT3抑制了M1型小胶质细胞的功能而促进M2型小胶质细胞的抗炎效应。对Sirt3-/-和Sirt3+/+小鼠在CCI病程各关键时间点采集的脑组织进行基因芯片检测和分析筛选发现,促凋亡蛋白XIAP相关因子1（XIAP-associated factor 1,XAF1）和鸟苷酸结合蛋白2（Guanylate-binding protein 2,GBP2）的m RNA表达量在Sirt3+/+样本中极低而在Sirt3-/-样本中呈现“去抑制性”激增,且表达差异随CCI的演变呈递增趋势。鉴于Xaf1和Gbp2的转录都受到I型干扰素的调控,XAF1和GBP2又可增强IFN-β（I型干扰素的一种）诱导的细胞凋亡;本研究将3-TYP（SIRT3特异性抑制剂）作用于HMC3小胶质细胞后给予LPS刺激,发现3-TYP作用后的HMC3细胞中IFN-β的转录水平较对照明显增高。同样在LPS刺激下,Sirt3-/-小鼠的小胶质细胞中组蛋白乙酰化水平（乙酰化的H4K16、H3K27和H3K56）以及活化的Caspase3（引起细胞凋亡的蛋白酶）明显增高。表明SIRT3使小胶质细胞的组蛋白去乙酰化并抑制了LPS刺激下I型干扰素诱导的细胞凋亡。有趣的是,SIRT3所抑制的STAT1和NF-κB-P65（促进M1型分化）亦是促凋亡信号通路的关键分子。综合上述,疼痛刺激以及疼痛的慢性化使中枢神经系统中的SIRT3发生适应性变化,而SIRT3缺失会加重CCI小鼠的症状（异常性疼痛和痛觉过敏）和神经炎症。SIRT3对神经病理性疼痛潜在的保护作用一方面是通过对小胶质细胞表型分化的调控,即抑制M1促炎表型、促进M2抗炎表型的分化;另一方面通过抑制小胶质细胞凋亡、增强脑组织对慢性疼痛刺激的耐受能力,使中枢炎症朝着有利于组织修复、内环境稳态的方向发展。
韩卫[9]（2020）在《Fidgetin Like 2-siRNA调控视神经损伤后神经节细胞存活和轴突再生研究》文中提出研究背景视觉信息占人类获取外界信息总量的85%,良好的视觉对人类的工作、生活至关重要。视神经是由视网膜神经节细胞（Retinal ganglion cell,RGC）的轴突汇聚而成。创伤造成的轴突损伤和RGC凋亡是视力不可逆丧失的常见原因。与中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）的其他细胞类似,RGC轴突的再生能力极差。这主要归因于:轴突内在的再生能力较差;损伤造成胶质瘢痕对轴突再生的阻遏作用。科学研究证实,细胞微管骨架剪切酶Fidgetin Like 2（FL2）能够影响中枢神经元轴突的再生,抑制FL2的活性可以明显促进脊髓背侧神经元轴突的再生,甚至可以跨越胶质瘢痕。作为细胞骨架的重要成分,微管对哺乳动物细胞的形态、运动、复制、迁徙具有重要功能。对中枢神经元来说,适度的微管稳定能够促进轴突的再生和抑制细胞凋亡。RGC与脊髓背侧的神经元类似,均属于中枢神经元细胞,而近期的诸多证明显示FL2在RGC的胞浆内广泛表达,因此抑制RGC中FL2的表达是否可以促进RGC细胞轴突的再生,进而使机体在视神经损伤后视觉得到有效恢复,值得进一步探讨。在以上研究的基础上,本论文从体内及体外两个方面进行研究,分析FL2-siRNA对RGC存活及轴突再生的影响,以期给予临床一定启发。第一部分:Fidgetin Like 2-siRNA调控视网膜神经节细胞存活和轴突再生体外研究目的:视神经损伤后出现的视神经纤维丢失及视网膜神经节细胞（RGCs）的进行性凋亡,引起视功能不可逆的下降。本研究通过对体外培养的RGC-5细胞系进行靶向基因沉默,探讨Fidgetin Like 2-siRNA对RGC-5细胞存活及轴突再生的影响。材料与方法:采用RGC-5细胞株,进行体外培养,选取第三代细胞作为研究对象,在高糖DMEM培养基中培养24h后,将其分成以下三组:Control组（细胞不做任何处理）、U-FIGN组（Fidgetin Like2的过表达质粒转染RGC-5细胞）、D-FIGN组（Fidgetin Like 2-siRNA沉默FL2在RGC-5细胞中的表达）。具体检测项目如下:RT-PCR检测各组FL2 mRNA的浓度;免疫组织化学染色观察各组细胞内FL2蛋白、IL-6及IL-1β的表达;免疫荧光观察各组细胞内FL2、GFAP、GAP-43及突触素（Synaptophysin,SYN）的表达;线粒体膜电位测定各组细胞线粒体膜电位;ATP合成能力检测;TUNEL检测各组细胞凋亡;CCK-8检测各组细胞增殖;透射电镜检测各组细胞器变化;划痕实验及Transwell实验检测各组细胞迁移能力;Western-blot检测各组细胞FL2、GFAP、GAP-43及突触素SYN表达。结果:RT-PCR检测:各组之间FL2 mRNA的蛋白表达趋势为D-FIGN<Control<U-FIGN。免疫组织化学染色:FL2蛋白、IL-6及IL-1β的表达趋势为D-FIGN组<Control组<U-FIGN 组。免疫荧光检测:FL2蛋白与GFAP各组表达趋势为D-FIGN组<Control组<U-FIGN组;GAP-43及SYN的表达趋势为U-FIGN组<Control组<D-FIGN组。线粒体膜电位分析:FL2低表达细胞的线粒体膜电位呈现出红色荧光,随着FL2含量增加,细胞红色荧光逐步向绿色荧光转变,线粒体能量逐步从高能量状态向低能量状态转变;ATP合成能力:各组之间数据趋势为U-FIGN组<Control组<D-FIGN组。FL2的过表达可以降低线粒体ATP合成能力,发生细胞内能量供应不足现象,导致细胞死亡。细胞凋亡及增殖:结果提示各组细胞的早期凋亡趋势为D-FIGN（0.81%±0.52）<Control（1.67%±0.71）<U-FIGN（2.12%±0.95）。细胞增殖趋势为 U-FIGN组<Control 组<D-FIGN 组。透射电镜:对照组及D-FIGN组细胞器形态较为正常,线粒体及高尔基体整体形态正常,周围溶酶体及脂质沉淀的分布较少,而在FL2过表达后,细胞内部明显充斥溶酶体及脂质沉淀,细胞炎性效应明显,同时线粒体肿大,提示中毒现象发生。细胞迁移:划痕实验、Transwell试验各组表达趋势为U-FIGN组<Control组<D-FIGN 组。WB结果:FL2及GFAP各组表达趋势为D-FIGN组<Control组<U-FIGN组。GAP-43及SYN各组表达趋势为U-FIGN组<Control组<D-FIGN组。结论:（1）实验过程中,FL2成功在RGC-5细胞内过表达或沉默;FL2具有一定致炎效应,它的过表达会导致RGC-5细胞炎性侵润程度加重,加剧RGC-5细胞的死亡。（2）FL2的过表达可以降低RGC-5细胞内线粒体ATP合成能力及膜电位变化,进而发生细胞内能量供应不足的现象,线粒体氧化还原状态失常、呼吸链解偶联,细胞无法得到足够的能量供给,发生凋亡或坏死。FL2沉默后线粒体功能有所改善,对RGC-5细胞具有保护作用。（3）在RGC-5细胞内,FL2过表达可以促进GFAP蛋白表达,激活星形胶质细胞,使得视神经损伤加剧,FL2沉默后,神经生长因子蛋白GAP-43表达增多,有利于细胞的存活及轴突再生过程。第二部分:Fidgetin Like 2-siRNA调控视神经损伤后神经节细胞存活和轴突再生体内研究目的:视神经损伤可导致视网膜神经节细胞（RGCs）的缺失、凋亡,引起不同程度的视力障碍。本研究通过钳夹视神经建立小鼠视神经损伤模型并加以干预,观察FL2-siRNA对视神经组织及RGC细胞损伤后的保护作用。材料与方法:本实验选取YFP小鼠45只作为研究对象,行双眼视神经钳夹伤手术,以建立视神经损伤模型。将小鼠分成三组:I-FIGN组（玻璃体腔内注射FL2-siRNA,1×10-3g/L,5μL）、P-FIGN（玻璃体腔内注射FL2的过表达质粒,1×10-3g/L,5μL）、Control组（玻璃体腔内注射生理盐水,5μL）;具体观察项目如下:HE染色观察各组小鼠视网膜组织形态;RGC细胞存活率检测;免疫荧光检测分析各组小鼠视网膜组织内FL2、GFAP、GAP-43及SYN蛋白表达;视交叉及对侧神经元轴突退行性改变观察;甲苯胺蓝染色观察视神经的退行性改变情况;Western-blot检测分析FL2、GFAP、GAP-43及SYN蛋白表达。结果:HE染色:Control组细胞炎性反应严重,细胞间的层次清晰性差,整体结构逐渐混乱,细胞间连接性差;在注射FL2-siRNA后,细胞的层次逐渐加强,轮廓明显,整体结构比较规则;而P-FIGN组,细胞明显凌乱,较Control组而言,细胞间连接较差。细胞存活率:各组细胞的存活率为P-FIGN<Control组<Ⅰ-FIGN组;免疫荧光检测:FL2及GFAP各组表达趋势Ⅰ-FIGN组<Control组<P-FIGN组;GAP-43 及 SYN 的表达趋势为 P-FIGN<Control 组<Ⅰ-FIGN 组。神经元退行性改变:对照组小鼠视神经轴突部分呈念珠状,视神经纤维周围出现浑浊。当FL2表达浓度降低后,视神经轴突的念珠状有所减轻,炎症反应减轻;FL2过表达后,其神经轴突的念珠状继续延伸,逐步恶化,神经轴突向碎片状转变,视神经的退行性病变较为严重。甲苯胺蓝染色:对照组小鼠细胞的轴突为深蓝色,髓鞘多为圆形和椭圆形,细胞大小适中同时分布较为均匀,FL2低表达后,其排列更加规则;而在FL2过表达后,神经节细胞的轴突出现肿胀变形并聚集成团,神经纤维的排列亦较为混乱。WB结果:FL2及GFAP各组表达趋势为Ⅰ-FIGN组<Control组<P-FIGN组;GAP-43及SYN各组表达趋势为P-FIGN<Control组<Ⅰ-FIGN组。结论:（1）小鼠视神经夹伤模型制备成功,FL2成功在RGC细胞内过表达或抑制表达,FL2会促进小鼠视网膜组织炎性反应,激活星形胶质细胞,损伤视神经、降低神经生长因子蛋白表达含量,抑制RGC细胞的存活以及轴突的发育过程。（2）FL2可降低RGC细胞的存活率,加速视神经节细胞的死亡,同时对视神经轴突的退行性改变具有促进作用,导致轴突团簇肿胀,呈现念珠状甚至是碎片状。FL2沉默后,RGC细胞的存活率升高,神经节细胞的形态更加规则,轴突的发育状况好转,与体外研究结论一致。FL2-siRNA可作为治疗视神经损伤药物的新方向,值得临床参考。
李越[10]（2019）在《新型组织工程神经调节的炎性微环境对大鼠SN长段缺损的修复作用》文中研究指明现代战争中各种火器的强大动能极易导致周围神经缺损,平时周围神经损伤则常见于交通事故、肿瘤切除、炎性疾病、先天性畸形等因素。缺损性周围神经损伤不仅难以修复,也给病人及社会带来沉重负担。与再生能力低下的中枢神经系统损伤相比,长度小于0.5cm的周围神经缺损可采用神经吻合术进行处理,预后往往较好。当神经缺损大于4cm时则首先采用自体神经移植进行修复,但以自体神经为供体不仅来源受限、匹配困难,也存在很多后遗症,且修复效果也并非尽如人意。同种异体神经虽已开展临床应用研究,但修复效果远不如自体神经,亦存在免疫排斥问题。近年来快速发展的组织工程神经技术为神经缺损修复带来了新希望,其优点在于:一是可以作为自体神经和同种异体神经的替代物,二是可以修复更长的神经缺损,三是可以根据神经缺损长度和直径“量身定做”。虽已有少量组织工程神经用于临床,但存在神经再生缓慢、神经结构和功能恢复欠佳等问题。从以往组织工程神经及其修复周围神经缺损的研究来看,目前学者正从以下几个方面对组织工程神经技术进行改进:一是支架材料的合成、筛选与神经导管制作,目前认为PLGA是较为理想的支架材料;二是选择更适宜的种子细胞,以往曾用种子细胞有ESCs、NSCs、BMSCs、ADSCs、DPSCs、SCs、OECs等多种,表皮神经嵴干细胞（Epidermal neural crest stem cells,EPI-NCSCs）易于获取、自我更新能力强、且具有多向分化、分泌神经营养因子、致瘤风险低等优点,显示了较好的应用前景;三是选择更优秀的细胞外基质,以强化移植修复过程中对神经再生的诱导和促进作用。同时,人们还发现,炎性免疫反应对于神经缺损的修复有十分重要的影响,这也成为近年研究的一个热点,对其进行探讨将有助于从机制上突破现有神经缺损修复的困境。炎性免疫反应在组织创伤修复过程中具有重要作用,深刻影响着神经再生的病理生理过程。炎性免疫反应是由免疫活性细胞和炎性细胞因子构成的复杂网络,近年来人们逐渐认识到巨噬细胞是这一网络中关键的免疫活性细胞,它在神经缺损修复过程中既能向M1型极化从而产生神经毒性,也能向M2型极化而利于神经损伤修复。目前认识到炎性细胞因子主要有两类,一类是促炎因子,如IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ等,可加剧炎性反应;另一类是抗炎因子,如IL-4、IL-10、IL-13、TGF-β1等,则可以抑制炎性反应。本研究在课题组既往建立的人工神经制备方法基础上,提出以EPI-NCSCs这样一种从自体毛囊获得的神经干细胞,结合PLGA支架及ECM细胞基质构建出新型组织工程神经,观察其桥接移植的修复效果,并着重从其对炎症反应调控的角度,研究其作用机制。首先将新型组织工程神经桥接于大鼠坐骨神经（Sciatic nerve,SN）缺损处（缺损总长度为15mm,该长度相当于人体神经缺损12.8-14.2cm）。再于桥接后9周内分别采用不同指标,观察新型组织工程神经在移植修复过程中对巨噬细胞的极化状态、炎性因子表达变化的调控及其对于缺损坐骨神经结构和功能的修复作用。拟解决的关键科学问题是:新型组织工程神经对局部神经组织内的巨噬细胞极化是否具有调节作用?新型组织工程神经能否调控局部炎性细胞因子的表达?调控后的炎性免疫微环境是否更有利于周围神经缺损的移植修复?材料与方法1.EPI-NCSCs培养与组织工程神经制作及坐骨神经桥接（1）细胞培养:EPI-NCSCs取自GFP转基因大鼠毛囊中,用DMEM/F12/FBS/bFGF培养液原代培养,PBS液洗涤覆有细胞的载玻片后,用Nestin/SOX10一抗工作液4℃孵育过夜,PBS漂洗后用Cy5-IgG/Alexa-Flour-594-IgG二抗工作液37℃避光孵育,然后计算SOX10+/Nestin+细胞数量。（2）PLGA支架:将PLA/PGA按85/15的比例混匀后溶于三氯甲烷制备5%溶液,玻璃培养皿中蒸发形成厚约25um的PLGA膜,然后卷膜制成PLGA导管,γ射线照射灭菌,用前以DMEM/F12浸润。（3）常规麻醉SD大鼠,暴露右侧坐骨神经,切除10mm坐骨神经,残端回缩形成长约15mm缺损。然后用PLGA导管套接于神经断端,注入25μL EPI-NCSCs/ECM,8-0缝线缝合断端,逐层缝合肌肉皮肤。2.调控巨噬细胞极化（1）免疫荧光鉴定:同上麻醉SD大鼠,暴露并取出长约20 mm坐骨神经,切为20μm冰冻切片,入TritonX-100 15分钟,山羊血清封闭1小时,用CD68/iNOS一抗（M1型巨噬细胞）和CD206/Arginase-1一抗（M2巨噬细胞）4℃孵育过夜,TRITC-IgG/FITC-IgG二抗避光孵育2小时,Hoechst33342细胞核染色,避光孵育30分钟。（2）成纤维细胞和SCs免疫荧光鉴定:SD大鼠麻醉后取出坐骨神经,制成20μm冰冻切片,用Vimentin一抗（成纤维细胞）和S-100一抗（SCs）孵育,二抗工作液为TRITC-IgG/FITC-IgG（1:200）,细胞核用Hoechst33342染色。3.炎性细胞因子调节（1）Western-blot测定:将所取坐骨神经匀浆后提取总蛋白,然后定量蛋白浓度,再进行SDS-PAGE电泳、转膜,用IL-4/IL-6/IL-13/TNF-α/actin一抗孵育,再用辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗孵育,PVDF膜曝光后用Image J图像分析软件测算条带灰度值,actin内参作对照。（2）免疫组化染色:SD大鼠麻醉、取出坐骨神经后制作4μm石蜡切片,脱蜡水化后经3%过氧化氢室温10分钟,山羊血清封闭1小时,用IL-4/IL-6/IL-13/TNF-α一抗过夜孵育,再用山羊抗兔/鼠IgG二抗孵育,链霉亲和素-过氧化物酶30分钟,DAB显色,光镜观察分析。（3）免疫荧光染色:SD大鼠麻醉、灌注固定、取出坐骨神经后后制作20μm冰冻切片,入0.3%TritonX-100室温15分钟,山羊血清室温封闭1小时,用IL-4/IL-6/IL-13/TNF-α一抗过夜孵育,二抗TRITC-IgG/FITC-IgG避光孵育2小时,Hoechst33342细胞核染色,荧光显微镜下拍照与分析。4.缺损坐骨神经修复（1）组织学观察:术后9周时麻醉、固定大鼠、取出坐骨神经行石蜡包埋,切4μm切片,HE染色,光学显微镜观察分析。（2）运动终板检测:术后9周取腓肠肌制作30μm冰冻切片,AChE染色,光学显微镜观察,Image ProPlus图像软件分析。（3）感觉功能评估:术后9周时将大鼠两侧后足浸入50℃热水中,记录两侧后足的回缩反射时间,痛温觉用LFRT表示。（4）运动功能评估:术后9周时记录大鼠后足足印迹,分别测量TS、ITS、PL,然后根据公式计算SFI。（5）神经电生理检测:术后9周时麻醉大鼠,暴露实验侧和正常侧坐骨神经,双钩状电极（极间距2 mm）刺激,双极针形电极记录,刺激间期0.25 ms,刺激强度10mA,刺激频率1Hz,每只大鼠重复记录5次,结果用PowerLab软件分析。（6）腓肠肌湿重恢复检测:术后9周时,麻醉大鼠后切取实验侧和正常侧腓肠肌,吸去血迹后立即用电子天平称重,结果以实验侧腓肠肌重量/正常侧腓肠肌重量×100%表示。5.统计学分析以SPSS（版本22.0）数据统计软件进行统计分析,以均数±标准差表示,以独立样本t检验进行组间比较,P<0.05表示存在显着性差异,P<0.01表示存在极显着性差异。结果1.从GFP大鼠毛囊中获得EPI-NCSCs,经SOX10和Nestin双标鉴定,其纯度高达99.23±2.1%,移植到缺损10mm坐骨神经后,至少在宿主组织内存活9周。所制作的PLGA导管管壁表面为网状结构,间有很多直径约6μm左右的微孔,从而为EPI-NCSCs粘附生长提供了结构基础,也为种子细胞获得环境营养提供了结构保障。2.组织工程神经桥接坐骨神经缺损后1周,可明显提高M2巨噬细胞的比例,降低M1巨噬细胞的数量。桥接后3周时,有利于神经再生的SCs数量和活性被显着提高,而阻碍神经再生的成纤维细胞数量和活性则被明显降低。在所用组织工程神经各成分中,种子细胞EPI-NCSCs在这些有益效应中发挥了关键作用。3.组织工程神经桥接坐骨神经缺损后1、3、7、14、21天,Western-blot、免疫荧光和免疫组化实验证实,宿主组织抗炎因子IL-4和IL-13的表达呈逐渐增强的趋势,而促炎因子IL-6和TNF-α则呈逐渐下降的趋势。抗炎因子水平的提高和促炎因子水平的下降,为坐骨神经损伤后的神经纤维再生提供了更适宜的炎性免疫微环境。4.术后9周时,形态组织学观察证实组织工程神经桥接恢复了缺损坐骨神经的连续性,且神经直径更粗,组织结构更致密,神经纤维成分更多,运动终板数量更多体积也更大。LFRT测定表明感觉功恢复更好。SFI评估显示明显提高了运动功能的恢复水平。与此同时,肌肉湿重恢复率明显优于对照组动物。神经电生理检查证实电位的潜伏期缩短,电位幅度提高,说明神经传导速度更快,对刺激反应更强。结论本研究制备的组织工程神经中的种子细胞EPI-NCSCs至少可在宿主组织内存活9周。组织工程神经在移植过程中一方面促使宿主组织内巨噬细胞向M2型极化,促进抗炎因子（IL-4,IL-13）表达,增加有利于神经纤维再生的SCs数量;另一方面降低M1巨噬细胞的数量,抑制促炎因子（IL-6,TNF-α）的表达,降低抑制神经纤维再生的成纤维细胞数量。组织工程神经调控的局部炎性免疫微环境提高了长节段缺损坐骨神经结构与功能的恢复水平。
二、神经生长因子对小鼠颈上神经节和大鼠腓神经损伤后修复的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、神经生长因子对小鼠颈上神经节和大鼠腓神经损伤后修复的影响（论文提纲范文）
（1）MicroRNA-21促进糖尿病角膜上皮修复及神经再生的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验设备与仪器 |
| 1.3 实验试剂与耗材 |
| 1.3.1 主要实验药物 |
| 1.3.2 主要实验试剂与一次性耗材 |
| 1.4 主要溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 WT与miR-21 KO小鼠鉴定 |
| 2.2 I型糖尿病小鼠模型的建立 |
| 2.3 小鼠角膜上皮损伤修复模型的建立 |
| 2.4 小鼠全角膜铺片神经染色 |
| 2.5 TUNEL免疫荧光染色 |
| 2.5.1 小鼠三叉神经节和眼球组织的TUNEL染色 |
| 2.5.2 小鼠原代三叉神经节细胞的TUNEL染色 |
| 2.6 RNA提取及反转录 |
| 2.6.1 引物序列 |
| 2.6.2 总RNA的提取 |
| 2.6.3 反转录cDNA |
| 2.6.4 RT-PCR反应 |
| 2.7 小鼠原代三叉神经节细胞的培养和处理 |
| 2.7.1 原代三叉神经节细胞的培养 |
| 2.7.2 原代三叉神经节细胞的处理 |
| 2.8 小鼠角膜上皮干/祖细胞系(TKE2)细胞的培养和处理 |
| 2.8.1 TKE2 细胞的培养 |
| 2.8.2 TKE2 细胞的分组和处理 |
| 2.9 细胞免疫荧光 |
| 2.10 mRNA转录组学分析 |
| 3 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 MiR-21 在糖尿病角膜上皮及三叉神经节中的表达 |
| 1.1 MiR-21 在糖尿病角膜上皮中的表达升高 |
| 1.2 MiR-21在糖尿病小鼠三叉神经节中的表达升高 |
| 1.3 MiR-21在角膜上皮损伤后表达升高,但是在糖尿病小鼠中的升高幅度低于正常小鼠 |
| 2 MiR-21 在糖尿病角膜病变中的作用 |
| 2.1 WT和 miR-21 KO糖尿病小鼠血糖及体重无明显差异 |
| 2.2 MiR-21 敲除抑制糖尿病小鼠角膜上皮损伤后的上皮修复及神经再生 |
| 2.3 MiR-21 敲除抑制糖尿病小鼠角膜神经生长 |
| 3 MiR-21 在糖尿病角膜病变中发挥的作用 |
| 3.1 MiR-21 改善高糖抑制的TKE2 细胞迁移 |
| 3.2 MiR-21 改善高糖诱导的TKE2 细胞凋亡 |
| 3.3 MiR-21 促进高糖环境下三叉神经节细胞轴突的生长 |
| 3.4 MiR-21 改善高糖环境下三叉神经节细胞的凋亡 |
| 3.5 MiR-21 敲除促进糖尿病小鼠角膜上皮及三叉神经节组织的凋亡 |
| 3.6 WT和 miR-21 KO糖尿病小鼠角膜上皮及三叉神经节组织mRNA转录组学分析 |
| 4.升高miR-21对糖尿病小鼠角膜上皮损伤修复及神经再生的影响 |
| 4.1 升高miR-21 促进糖尿病小鼠角膜上皮损伤修复及神经再生 |
| 4.2 升高miR-21 抑制糖尿病小鼠角膜上皮组织和三叉神经节组织的凋亡 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 miRNA与糖尿病性角膜病变研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（2）AAV-NT3与运动对脊髓损伤后肢体痉挛的干预及新型基因载体AAV-CPP.16的初步构建（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 脊髓损伤后肌肉痉挛神经机制的研究进展 |
| 1.1.1 脊髓损伤后肌肉痉挛概述 |
| 1.1.2 脊髓损伤后肌肉痉挛的发生机制 |
| 1.2 以构建新型腺相关病毒为代表的基因疗法 |
| 1.2.1 基因疗法概述 |
| 1.2.2 腺相关病毒作为基因疗法关键工具的研究进展 |
| 1.3 神经营养因子3 的研究现状 |
| 1.3.1 概述 |
| 1.3.2 神经营养因子3 在脊髓损伤后肌肉痉挛中的作用 |
| 1.4 运动干预与脊髓损伤可塑性 |
| 1.4.1 概述 |
| 1.4.2 运动干预疗法在脊髓损伤后肌肉痉挛中的作用 |
| 1.5 选题依据及研究意义 |
| 第2章 编码人神经营养因子3 的腺相关病毒的构建及其在大鼠后肢肌肉及背根神经节中的表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物与细胞系 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器与耗材 |
| 2.1.4 实验试剂的配制 |
| 2.2 实验方法与步骤 |
| 2.2.1 重组腺相关病毒载体的制备 |
| 2.2.2 重组腺相关病毒的注射 |
| 2.2.3 Western blot法检测NT3 蛋白的表达变化 |
| 2.2.4 大鼠脊髓组织NT3 的半定量分析 |
| 2.2.5 统计学处理 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 大鼠后肢肌肉中人神经营养因子3 的表达 |
| 2.3.2 大鼠脊髓背根神经节中神经营养因子3 的表达 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 编码人神经营养因子3 的腺相关病毒与运动干预对大鼠脊髓损伤后肌肉痉挛的保护作用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器与耗材 |
| 3.2 实验方法与步骤 |
| 3.2.1 实验设计 |
| 3.2.2 脊髓挫伤模型的建立 |
| 3.2.3 运动训练 |
| 3.2.4 游泳测试 |
| 3.2.5 BBB评分 |
| 3.2.6 H反射的RDD记录 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 AAV-NT3、运动干预及二者的联合治疗对大鼠脊髓损伤后游泳测试时痉挛行为发生频率的影响 |
| 3.3.2 单独或联合治疗对后肢运动功能的影响 |
| 3.3.3 单独或联合治疗对H反射RDD的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 编码人神经营养因子3 的腺相关病毒与运动干预对大鼠脊髓损伤后肌肉痉挛保护作用的机制研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器与耗材 |
| 4.2 实验方法与步骤 |
| 4.2.1 脊髓切片的灌注、固定和免疫荧光染色 |
| 4.2.2 免疫荧光定量 |
| 4.2.3 蛋白质印迹 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 单独或联合治疗后脊髓运动神经元及突触素(SYN)的变化 |
| 4.3.2 单独或联合治疗后 Ch AT 兴奋性中间神经元可塑性变化 |
| 4.3.3 单独或联合治疗后GABA抑制性中间神经元可塑性变化 |
| 4.3.4 单独或联合治疗后脊髓KCC2 蛋白表达的变化 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 新型中枢靶向性基因载体AAV-CPP.16 的构建 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物与细胞系 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 实验仪器 |
| 5.1.4 实验试剂的配置 |
| 5.2 实验方法与步骤 |
| 5.2.1 生产病毒载体所需的质粒构建 |
| 5.2.2 重组腺相关病毒载体的制备 |
| 5.2.3 中枢靶向性基因载体AAV-CPP.16的构建模式 |
| 5.2.4 新一代血脑屏障3D体外模型构建、鉴定与AAV筛选 |
| 5.2.5 小鼠尾静脉注射进行AAV体内筛选 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 小鼠体内筛选高效率转导的新型中枢靶向性病毒载体 |
| 5.3.2 血脑屏障3D体外模型验证AAV-CPP.16 穿透BBB的 能力 |
| 5.3.3 探索适宜的用于小鼠体内AAV-CPP.16 的病毒载量 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 新型中枢靶向性基因载体AAV-CPP.16的转导效率 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.2 实验方法与步骤 |
| 6.2.1 小鼠尾静脉注射 |
| 6.2.2 小鼠侧脑室病毒注射 |
| 6.2.3 脊髓和外周组织器官切片的灌注、固定和免疫荧光染色 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 IV注射AAV-CPP.16 靶向脊髓的转导效率 |
| 6.3.2 IV注射AAV-CPP.16 靶向脊髓运动神经元的转导效率 |
| 6.3.3 IV注射AAV-CPP.16 靶向脊髓背根神经节的转导效率 |
| 6.3.4 IV注射AAV-CPP.16 外周毒性研究 |
| 6.3.5 ICV注射AAV-CPP.16 在小鼠大脑中的转导效率 |
| 6.3.6 ICV注射AAV-CPP.16 靶向脊髓的转导效率 |
| 6.3.7 ICV注射AAV-CPP.16 靶向脊髓运动神经元的转导效率 |
| 6.3.8 ICV注射AAV-CPP.16 靶向脊髓背根神经节的转导效率 |
| 6.3.9 ICV注射AAV-CPP.16 外周毒性研究 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第7章 结论 |
| 7.1 研究工作总结 |
| 7.2 本研究的创新性 |
| 7.3 工作局限及未来方向 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）电刺激联合Cs-Au/GelMA水凝胶对臂丛神经损伤后神经病理性疼痛的疗效及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 综述 |
| 2.1 神经病理性疼痛的概述 |
| 2.2 神经病理性疼痛的调节机制 |
| 2.2.1 神经胶质细胞在神经病理性疼痛中的调节机制 |
| 2.2.2 脑源性神经营养因子在神经病理性疼痛中的调节机制 |
| 2.2.3 促炎症细胞因子在神经病理性疼痛中的调节机制 |
| 2.2.4 趋化因子在神经病理性疼痛中的调节机制 |
| 2.3 神经病理性疼痛的治疗 |
| 2.4 神经病理性疼痛的动物模型 |
| 2.4.1 脊神经选择性结扎模型 |
| 2.4.2 脊神经根切断模型 |
| 2.4.3 坐骨神经轴索切断模型 |
| 2.4.4 坐骨神经慢性压缩性损伤 |
| 2.4.5 坐骨神经半结扎模型 |
| 2.4.6 坐骨神经分支损伤模型 |
| 2.4.7 臂丛神经损伤模型 |
| 2.5 总结 |
| 第3章 臂丛神经损伤后病理性神经痛产生的病理生理基础 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 仪器耗材 |
| 3.2.2 药品试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 实验动物 |
| 3.3.2 手术造模 |
| 3.3.3 机械性刺激缩足阈值(MWT)检测 |
| 3.3.4 热缩足反射潜伏期(TWL)检测 |
| 3.3.5 免疫印迹实验 |
| 3.3.6 统计分析 |
| 3.4 研究结果 |
| 3.4.1 机械性刺激缩足阈值(MWT)行为学改变 |
| 3.4.2 热缩足反射潜伏期(TWL)行为学改变 |
| 3.4.3 PCRA术后大鼠脊髓组织中小胶质细胞的变化 |
| 3.4.4 PCRA术后大鼠脊髓组织中星形胶质细胞的变化 |
| 3.4.5 PCRA术后大鼠小脊髓组织中促炎症细胞因子的变化 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 CS-Au/GelMA水凝胶的制备与表征 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 仪器耗材 |
| 4.2.3 药品试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 神经干细胞的提取和培养 |
| 4.3.2 神经干细胞滴片培养 |
| 4.3.3 免疫荧光染色法鉴定神经干细胞 |
| 4.3.4 Gel MA水凝胶的合成 |
| 4.3.5 Cs-Au纳米粒子的制备 |
| 4.3.6 Cs-Au纳米粒子的表征 |
| 4.3.7 Cs-Au纳米粒子生物安全性的检测 |
| 4.3.8 Cs-Au/Gel MA水凝胶的制备与表征 |
| 4.3.9 Cs-Au/Gel MA水凝胶的体内降解 |
| 4.4 研究结果 |
| 4.4.1 神经干细胞的提取与鉴定 |
| 4.4.2 Gel MA水凝胶的制备 |
| 4.4.3 Cs-Au纳米粒子的表征 |
| 4.4.4 Cs-Au纳米粒子生物安全性的检测 |
| 4.4.5 Cs-Au/Gel MA水凝胶的亲水性和机械性能 |
| 4.4.6 Cs-Au/Gel MA水凝胶的体内降解 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 CS-Au/GelMA水凝胶联合电刺激治疗在PCRA后神经病理性疼痛中的作用及机制 |
| 5.1 研究背景 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 仪器耗材 |
| 5.2.3 药品试剂 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 神经干细胞的提取和培养 |
| 5.3.2 细胞实验筛选电刺激频率 |
| 5.3.3 手术造模及分组治疗 |
| 5.3.4 免疫印迹实验 |
| 5.3.5 免疫荧光实验 |
| 5.3.6 机械性刺激缩足阈值(MWT)检测 |
| 5.3.7 热缩足反射潜伏期(TWL)检测 |
| 5.3.8 统计分析 |
| 5.4 研究结果 |
| 5.4.1 电刺激对神经干细胞 |
| 5.4.2 PCRA术后大鼠脊髓组织中小胶质细胞的变化 |
| 5.4.3 PCRA术后大鼠脊髓组织中星形胶质细胞的变化 |
| 5.4.4 PCRA术后大鼠小脊髓组织中促炎症细胞因子的变化 |
| 5.4.5 机械性刺激缩足阈值(MWT)行为学改变 |
| 5.4.6 热缩足反射潜伏期(TWL)行为学改变 |
| 5.4.7 脑源性神经营养因子变化 |
| 5.4.8 氧化损伤标志物变化 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）二甲双胍对周围神经急性损伤修复作用的机制研究和临床试验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 二甲双胍促进小鼠坐骨神经急性损伤修复的实验观察 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 二甲双胍诱导自噬促进小鼠坐骨神经恢复的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 二甲双胍联合甲钴胺治疗周围神经损伤的临床研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 二甲双胍诱导的自噬在临床治疗中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）仿生导电人工神经支架的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 多微通道导电神经支架的设计和制备及物理性能和生物相容性能检测评价 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 实验对象及主要试剂 |
| 1.3 实验分组及方法 |
| 1.4 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 聚左旋乳酸取向性纤维膜及其生物相容性的研究 |
| 1 研究方法与内容 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 实验对象及主要试剂 |
| 1.3 实验分组及方法 |
| 1.4 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 仿生导电人工神经支架修复大鼠坐骨神经缺损的研究 |
| 1 研究方法与内容 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 实验对象和主要试剂 |
| 1.3 实验分组和方法 |
| 2 结果 |
| 3.讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 周围神经损伤修复的细胞和分子机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（6）激活素A参与缺血性脑损伤小胶质细胞极化表型变化的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 小胶质细胞研究进展 |
| 2.1.1 小胶质细胞的活性状态 |
| 2.2 小胶质细胞与缺血性脑损伤 |
| 2.2.1 小胶质细胞参与缺血性脑损伤的神经免疫反应 |
| 2.2.2 小胶质细胞参与缺血性脑损伤的神经炎症反应 |
| 2.3 Activin A/Smads信号通路在缺血性脑损伤中作用的研究进展 |
| 2.3.1 ActivinA/Smads信号转导 |
| 2.3.2 ActivinA参与缺血性脑损伤的病理生理过程 |
| 2.3.3 ActivinA与小胶质细胞 |
| 第3章 局灶性缺血性脑损伤中Act A/Smads信号通路的表达变化 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 大脑中动脉阻塞局灶性脑缺血模型建立 |
| 3.1.5 神经功能评分 |
| 3.1.6 脑梗死体积测定 |
| 3.1.7 苏木精—伊红染色 |
| 3.1.8 Western blot |
| 3.1.9 实时荧光定量PCR (Quantitative Realtime-PCR) |
| 3.1.10 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 MCAO模型不同缺血时间后的神经功能评分 |
| 3.2.2 脑梗死体积测定 |
| 3.2.3 脑组织神经元病理形态改变 |
| 3.2.4 MCAO模型不同缺血时间组ActA基因表达 |
| 3.2.5 MCAO模型不同缺血时间组ActRⅡ基因表达 |
| 3.2.6 MCAO模型不同缺血时间组Smad2蛋白表达 |
| 3.2.7 MCAO模型不同缺血时间组Smad7蛋白表达 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 局灶性缺血性脑损伤小胶质细胞表型变化研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验动物及动物模型建立 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 免疫组化分析 |
| 4.1.5 实时荧光定量PCR(Quantitative Realtime-PCR) |
| 4.1.6 统计学分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 MCAO模型不同组别M1型标志物iNOS基因表达 |
| 4.2.2 MCAO模型不同组别M1型标志物CD86基因表达 |
| 4.2.3 MCAO模型不同组别M2型标志物CD206基因表达 |
| 4.2.4 MCAO模型不同组别M2型标志物Arg-1基因表达 |
| 4.2.5 iNOS和CD206免疫组织化学染色结果 |
| 4.2.6 神经元细胞标志物NeuN、小胶质细胞标志物Iba1免疫组织化学 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 ACTA对局灶性缺血性脑损伤小胶质细胞表型变化的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.1.4 大脑中动脉阻塞局灶性脑缺血模型建立 |
| 5.1.5 侧脑室微量注射 |
| 5.1.6 实时荧光定量PCR(Quantitative Realtime-PCR) |
| 5.1.7 免疫组化分析 |
| 5.1.8 神经功能评分 |
| 5.1.9 脑梗死体积测定 |
| 5.1.10 统计学分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 神经功能评分 |
| 5.2.2 脑梗死体积 |
| 5.2.3 ActA干预后各组M1型标志物iNOS基因表达 |
| 5.2.4 Act A干预后各组M2型标志物CD206基因表达 |
| 5.2.5 Act A干预后各组Act A/Smads信号通路Smad3、ActRⅡ的基因表达 |
| 5.2.6 Act A干预后各组iNOS和CD206免疫组织化学染色结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 ACTA对小胶质细胞体外OGD/R过程中M1、M2表型表达的影响 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验细胞 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.1.4 BV2细胞OGDR模型建立 |
| 6.1.5 Wsstern blot |
| 6.1.6 ActA给药方法 |
| 6.1.7 CCK8检测细胞活力 |
| 6.1.8 统计学分析 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 OGD/R损伤对BV2细胞活力的影响 |
| 6.2.2 Act A/Smads信号通路在BV2细胞OGD/R损伤后的表达 |
| 6.2.3 小胶质细胞表型标志物在BV2细胞OGD/R损伤后的表达 |
| 6.2.4 ActA干预BV2细胞OGD/R过程Act A/Smads信号通路及小胶质细胞标志物表达 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（7）基于基因组学探究AKBA对大鼠坐骨神经损伤的修复机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 周围神经损伤 |
| 1.1.1 周围神经损伤性疾病在小动物临床的发病情况 |
| 1.1.2 周围神经损伤的病理变化 |
| 1.2 周围神经损伤修复 |
| 1.2.1 周围神经损伤后对神经元的修复 |
| 1.2.2 周围神经损伤后对轴突的修复 |
| 1.3 神经营养因子在神经损伤修复中的作用 |
| 1.3.1 神经营养因子受体在神经损伤修复中的作用 |
| 1.3.2 神经生长因子在神经损伤修复中的作用 |
| 1.3.3 脑源性神经营养因子在神经损伤修复中的作用 |
| 1.4 AKBA在周围神经损伤中的作用 |
| 1.5 甲钴胺在周围神经损伤中的作用 |
| 1.6 目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器与试剂 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.2 试验动物及分组 |
| 2.2.1 试验动物的饲养 |
| 2.2.2 大鼠坐骨神经损伤模型的制作与分组 |
| 2.3 大鼠坐骨神经损伤后修复的检测指标与方法 |
| 2.3.1 大鼠坐骨神经感觉功能的测试 |
| 2.3.2 大鼠坐骨神经功能指数的测定 |
| 2.3.3 大鼠坐骨神经组织学观察 |
| 2.3.4 大鼠坐骨神经超微结构观察 |
| 2.4 大鼠坐骨神经基因组学的检测 |
| 2.4.1 坐骨神经的样品采样与保存 |
| 2.4.2 rRNA去除链特异性文库构建 |
| 2.4.3 数据分析 |
| 2.5 大鼠坐骨神经MRNA表达的检测 |
| 2.5.1 坐骨神经组织总RNA的提取 |
| 2.5.2 坐骨神经组织cDNA的合成 |
| 2.5.3 引物的合成和实时荧光定量PCR(q RT-PCR) |
| 2.6 大鼠坐骨神经蛋白质含量的检测 |
| 2.6.1 坐骨神经蛋白质的提取 |
| 2.6.2 Western Blot |
| 2.7 数据统计与分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 AKBA对大鼠坐骨神经损伤后SFI测试结果 |
| 3.2 AKBA对大鼠坐骨神经损伤后感觉功能测定结果 |
| 3.3 AKBA对大鼠坐骨神经损伤后髓鞘修复的观察结果 |
| 3.4 AKBA对大鼠坐骨神经损伤后神经纤维修复的观察结果 |
| 3.5 ABKA对大鼠坐骨神经损伤后髓鞘超微结构修复观察结果 |
| 3.6 AKBA对大鼠坐骨神经损伤后MBP表达检测结果 |
| 3.7 AKBA对大鼠坐骨神经损伤后 β3Tubulin 表达检测结果 |
| 3.8 AKBA对大鼠坐骨神经损伤后基因组学检测结果 |
| 3.8.1 大鼠坐骨神经显着差异基因筛选结果 |
| 3.8.2 大鼠坐骨神经差异m RNA表达基因GO分析结果 |
| 3.8.3 大鼠坐骨神经m RNA差异基因KEGG分析结果 |
| 3.9 AKBA对大鼠坐骨神经相关MRNA表达检测结果 |
| 3.10 AKBA对大鼠坐骨神经相关蛋白含量检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 AKBA对大鼠坐骨神经损伤修复的行为学影响 |
| 4.2 AKBA对大鼠坐骨神经损伤修复的组织学影响 |
| 4.3 AKBA对大鼠坐骨神经损伤修复的基因组学分析 |
| 4.3.1 AKBA对大鼠坐骨神经损伤修复的基因组学GO分析 |
| 4.3.2 AKBA对大鼠坐骨神经损伤修复的基因组学KEGG分析 |
| 4.4 AKBA对大鼠坐骨神经损伤后相关基因和蛋白的影响 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（8）SIRT3通过调控小胶质细胞分化和凋亡改善慢性神经病理性疼痛中枢炎症的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 实验结果 |
| 一、小鼠单侧坐骨神经慢性压迫损伤后疼痛表型变化 |
| 二、神经病理性疼痛慢性化进程中脑组织的基因富集分析 |
| 三、SIRT3在神经病理性疼痛慢性化过程中的表达变化 |
| 四、Sirt3基因敲除对神经病理性疼痛表型和大脑炎症的影响 |
| 五、Sirt3基因敲除对慢性疼痛相关脑区小胶质细胞的影响 |
| 六、SIRT3对小胶质细胞表型分化的影响 |
| 七、SIRT影响小胶质细胞表型分化的相关信号通路 |
| 八、SIRT3抑制小胶质细胞凋亡 |
| 九、Sirt3基因敲除对小胶质细胞相关炎症介质的影响 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 慢性神经病理性疼痛相关中枢炎症的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（9）Fidgetin Like 2-siRNA调控视神经损伤后神经节细胞存活和轴突再生研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分: Fidgetin Like 2-siRNA调控视网膜神经节细胞存活和轴突再生体外研究 |
| 研究背景 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 研究结论 |
| 第二部分: Fidgetin Like 2-siRNA调控视神经损伤后神经节细胞存活和轴突再生体内研究 |
| 研究背景 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 研究结论 |
| 参考文献 |
| 综述 视神经损伤后修复与再生研究论述 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（10）新型组织工程神经调节的炎性微环境对大鼠SN长段缺损的修复作用（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 新型组织工程神经制作与大鼠坐骨神经长段缺损损伤模型的建立 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 组织工程神经对坐骨神经缺损损伤后巨噬细胞极化及炎性细胞的影响 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 组织工程神经修复坐骨神经缺损过程中对炎性细胞因子的调节作用 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 组织工程神经对坐骨神经长段缺损的结构和功能修复作用 |
| 5.1 研究背景 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 全文总结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 巨噬细胞极化在神经系统损伤修复中的作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的成果 |
| 致谢 |
四、神经生长因子对小鼠颈上神经节和大鼠腓神经损伤后修复的影响（论文参考文献）
- [1]MicroRNA-21促进糖尿病角膜上皮修复及神经再生的研究[D]. 冯莉娟. 青岛大学, 2021(02)
- [2]AAV-NT3与运动对脊髓损伤后肢体痉挛的干预及新型基因载体AAV-CPP.16的初步构建[D]. 常宇鑫. 吉林大学, 2021(01)
- [3]电刺激联合Cs-Au/GelMA水凝胶对臂丛神经损伤后神经病理性疼痛的疗效及机制研究[D]. 尤荻. 吉林大学, 2021(01)
- [4]二甲双胍对周围神经急性损伤修复作用的机制研究和临床试验研究[D]. 刘雷. 河北医科大学, 2021(02)
- [5]仿生导电人工神经支架的研究[D]. 刘振辉. 新疆医科大学, 2021(08)
- [6]激活素A参与缺血性脑损伤小胶质细胞极化表型变化的研究[D]. 刘洪雨. 吉林大学, 2020(04)
- [7]基于基因组学探究AKBA对大鼠坐骨神经损伤的修复机制[D]. 汪瑶. 东北农业大学, 2020(07)
- [8]SIRT3通过调控小胶质细胞分化和凋亡改善慢性神经病理性疼痛中枢炎症的机制研究[D]. 李文迁. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [9]Fidgetin Like 2-siRNA调控视神经损伤后神经节细胞存活和轴突再生研究[D]. 韩卫. 郑州大学, 2020(02)
- [10]新型组织工程神经调节的炎性微环境对大鼠SN长段缺损的修复作用[D]. 李越. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019