一、解离素-金属蛋白酶蛋白家族的基础与临床意义（论文文献综述）
陈明,陈小鹤,杨守杭,陈帆[1]（2022）在《解离素-金属蛋白酶17在恶性胸腔积液中的变化及其临床应用价值的研究》文中进行了进一步梳理目的研究解离素-金属蛋白酶17（ADAM17）在恶性胸腔积液中的表达情况,探讨其在恶性胸腔积液中的诊断价值。方法收集35例恶性胸腔积液患者和57例良性胸腔积液患者样本,收集患者一般资料,通过ELISA法测量胸腔积液中ADAM17水平。结果 ADAM17在恶性胸腔积液组与良性胸腔积液组中的含量分别为346.8（125.6～681.8） pg/ml和97.7（78.2～132.6） pg/ml,差异有统计学意义（P <0.001）; ROC曲线分析ADAM17检测的灵敏度为63%,特异度为95%,AUC为0.837,最佳cut-off值为308.76 pg/ml。ADAM17与CEA、CYFRA 21-1、总蛋白、葡萄糖以及乳酸脱氢酶存在相关性（P <0.05）,与钠、钾、氯以及年龄无相关（P> 0.05）。良性胸腔积液组中,ADAM17与各项指标均无相关（P> 0.05）。结论
董德刚,王万春,邓中平[2]（2020）在《蛇毒研究进展:从致命毒素到新药开发》文中指出毒蛇咬伤是热带与亚热带地区常见急重症,其公共卫生重要性在很大程度上被忽视。蛇毒含有丰富的蛋白质、多肽等其他毒素,其中许多成分可以靶向多种离子通道、细胞受体和膜转运蛋白。与传统小分子药物相比,蛇毒蛋白和多肽对靶标具有更强的特异性和亲和力,尤其适用于新型药物设计。现有研究显示,蛇毒及其成分具有作为新药先导化合物的巨大发展潜力。本文对蛇毒主要组分、蛇毒毒性效应与解毒策略,以及蛇毒药理活性与医学应用等方面的最新进展进行综述,旨在为蛇伤临床诊治及基于蛇毒的新药开发提供参考与借鉴。
单嘉男[3]（2020）在《粪类圆线虫Ss-ast-1虾青素金属蛋白酶编码基因的鉴定与表达分析》文中研究指明线虫是后生动物中种类丰富的动物之一。由于线虫的结构简单,一些线虫已被用作神经和进化研究的模型生物,如秀丽隐杆线虫。然而,在线虫类中,有一类感染动物的线虫,又称寄生线虫,给农业生产和人类健康带来了极大的危害。据WHO报道,全球约八分之一的人感染有寄生性线虫,而粪类圆线虫（Strongyloides stercoralis）正是其中一种。由粪类圆线虫引起的疾病称为粪类圆线虫病,是一种广泛存在却易被忽视的热带疾病（Neglected Tropical Diseases,NTD）,主要在非洲等卫生条件落后的地区流行。到目前为止尚且没有简单快捷的诊断手段,也没有疫苗可用于预防粪类圆线虫病。虾青素金属蛋白酶是一种广泛存在于多种动植物体内的金属蛋白酶,研究表明该蛋白酶在寄生线虫的入侵和生长发育过程中发挥重要作用,有望成为新的检测和制备疫苗的靶位点。本项目首先通过分析粪类圆线虫在各个时期的转录组数据并从中筛选出假定为虾青素金属蛋白酶的蛋白,再通过与已经报道过的金属蛋白酶进行氨基酸序列比对来选定所要研究的基因,最后选定粪类圆线虫虾青素金属蛋白酶Ss-ast-1作为研究对象。本项目以原核表达的方式体外重组表达了该蛋白,并对该蛋白酶的活性进行了探究,此外又通过显微注射的方法对Ss-ast-1的表达特征进行了探究。（1）选定粪类圆线虫Ss-ast-1作为目标基因由粪类圆线虫的全转录组数据中可以得到49个标注为金属蛋白酶的基因,将这些金属蛋白酶与之前在线虫中已报道过的虾青素金属蛋白酶放在一起构建进化树的方式对49个金属蛋白酶进行筛选,最终选定Ss-ast-1作为研究目标。（2）粪类圆线虫Ss-ast-1金属蛋白酶基因序列和氨基酸序列的结构分析Ss-ast-1的c DNA序列是从Wormbase Parasite上得到,其中编码区为1905bp,编码634个氨基酸。通过分析可知,前32个氨基酸为信号肽,氨基酸序列比对发现虾青素金属蛋白酶Ss-AST-1具有保守的功能结构域,比如Zine-binding、Met-turn、EGF-like domain等,同时对Ss-AST-1进行三维同源建模分析。预测的Ss-ast-1启动子的全长为468 bp,具有多种真核生物保守的启动子调控元件。（3）粪类圆线虫Ss-ast-1虾青素金属的转录水平和定位分析通过转录组分析发现,该基因在粪类圆线虫的各个发育阶段均有表达,在i L3期的表达水平最高。通过显微注射,可以得到荧光虫卵,该蛋白虫卵细胞的细胞核和细胞质均有表达。（4）原核表达粪类圆线虫Ss-AST-1蛋白体外原核表达并从包涵体中纯化Ss-AST-1,纯化的蛋白一部分用于酶活性实验,一部分用于制备多克隆抗体,Western blot分析表明多克隆抗体可以较好的识别全虫蛋白中的Ss-AST-1,表明该蛋白具有良好的免疫原性。本研究首次对粪类圆线虫Ss-ast-1的基因结构和功能进行了初步研究,证明Ss-ast-1在虫卵中表达,并具有良好的免疫原性,为之后开发疫苗和新的检测手段提供了一定的理论基础。
宋晓改[4]（2020）在《ADAM9在酒精性肝纤维化中的作用及调控的分子机制研究》文中研究表明目的本研究利用CRISPR/Cas9技术,进行基因编辑ADAM9序列,抑制其基因表达,旨在研究ADAM9在小鼠酒精性肝纤维化中的作用及调控的分子机制研究。方法（一）ADAM9-sg RNA3转染大鼠肝星状细胞HSC-T6:将本实验室前期筛选的有活性的ADAM9-sg RNA3质粒转染大鼠肝星状细胞HSC-T6,经过嘌呤酶素筛选,提取转染成功的细胞DNA进行PCR扩增、电泳、胶回收,然后进行测序,以此来验证有效sg RNA3蛋白。（二）体外实验:培养大鼠肝星状细胞HSC-T6,分为四组,正常HSC-T6对照组:不做任何处理;正常HSC-T6+酒精组:直接用酒精诱导培养;ADAM9-sg RNA3+酒精组:将有效sg RNA3进行稳定转染后给予酒精诱导培养;JNK抑制剂+酒精组:将JNK抑制剂SP600125和培养液混匀加入细胞温育24小时,再和酒精一起诱导细胞培养。免疫印迹检测相关因子表达:解整合素-金属蛋白酶ADAM9,c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号通路磷酸化蛋白p-c-Jun,平滑肌肌动蛋白α-SMA,增殖细胞核抗原PCNA,细胞凋亡相关蛋白Caspase-3。（三）体内实验:健康清洁的C57BL/6J雄性小鼠220只,随机分为4组:A组:正常对照组（10只）:采用对照Lieber-De Carli饲料TP4030C喂养;B组:生理盐水+酒精组（70只）:尾静脉注射生理盐水;C组:ADAM9-sg RNA3+酒精组（70只）:尾静脉注射有效ADAM9-sg RNA3质粒;D组:JNK抑制剂+alcohol组（70只）:尾静脉注射JNK抑制剂SP600125;B、C、D组分别采用Lieber-De Carli酒精饲料TP4030A喂养4周,之后联合腹腔注射5%CCl4橄榄油溶液2ml/kg,2次/周,直到第8周,建立小鼠酒精性肝纤维化动物模型,第8周集中处死,摘除眼球取血,分离小鼠血清检测AST、ALT这两个酶的数值;肝脏处理后,进行石蜡切片苏木精-伊红染色（HE染色）检测小鼠肝脏损伤情况;天狼星红染色检测小鼠肝脏纤维化程度;Hoechst33258细胞凋亡染色检测肝细胞的凋亡情况;免疫印迹检测相关因子表达:ADAM9,PCNA,血管内皮生长因子VEGF,细胞凋亡相关蛋白Bax,应激蛋白HSP70,代谢关键酶细胞色素P4502E1（CYP2E1）,肿瘤坏死因子TNF-α,α-SMA,p-c-Jun。结果DNA测序结果显示sg RNA3组基因序列与正常基因序列相比,差异大,蛋白免疫印迹结果显示:转染ADAM9-sg RNA3质粒的HSC-T6细胞ADAM9蛋白表达量较正常HSC-T6+酒精组细胞的表达量明显降低（P<0.01）,差异具有显着统计学意义,因此确定sg RNA3为有效向导RNA。体外实验:1.蛋白免疫印迹实验结果:与正常HSC-T6+酒精组相比,ADAM9-sg RNA3+酒精组和JNK抑制剂+酒精组细胞ADAM9,p-c-Jun,α-SMA,PCNA的蛋白表达量显着降低（P<0.01）,而Caspase-3的蛋白表达量显着上升（P<0.05或P<0.01）。体内实验:1.血清转氨酶变化情况:生理盐水+酒精组和ADAM9-sg RNA3+酒精组、JNK抑制剂+酒精组小鼠血清中AST、ALT水平较正常组明显升高（P<0.01或P<0.05）,其中ADAM9-sg RNA3+酒精组和JNK抑制剂+酒精组小鼠血清中AST、ALT水平显着低于生理盐水+酒精组（P<0.01或P<0.05）,JNK抑制剂+酒精组小鼠血清中AST、ALT水平与ADAM9-sg RNA3+酒精组相比降低更加明显（P<0.05）。2.苏木精-伊红染色情况:与正常组相比,生理盐水+酒精组和ADAM9-sg RNA3+酒精组以及JNK抑制剂+酒精组小鼠均出现显着肝损伤（P<0.01）;与生理盐水+酒精组小鼠相比,ADAM9-sg RNA3+酒精组和JNK抑制剂+酒精组小鼠肝细胞坏死显着降低（P<0.01）;与ADAM9-sg RNA3+酒精组相比,JNK抑制剂+酒精组小鼠肝细胞坏死降低更明显（P<0.05）。3.苦味酸-天狼星红染色结果:与正常组小鼠相比,其余三组小鼠都发生了显着的肝纤维化（P<0.01或P<0.05）,与生理盐水+酒精组小鼠相比,ADAM9-sg RNA3+酒精组和JNK抑制剂+酒精组小鼠肝纤维化减轻更加显着（P<0.01）;与ADAM9-sg RNA3+酒精组相比,JNK抑制剂+酒精组小鼠肝纤维化减轻更加明显（P<0.05）。4.Hoechst33528染色结果:与正常组小鼠相比,生理盐水+酒精组和ADAM9-sg RNA3+酒精组及JNK抑制剂+酒精组小鼠都发生了显着的肝细胞凋亡（P<0.01）;与生理盐水+酒精组小鼠相比,ADAM9-sg RNA3+酒精组和JNK抑制剂+酒精组小鼠肝细胞凋亡的数目有所减少（P<0.05或P<0.01）;与ADAM9-sg RNA3+酒精组小鼠相比,JNK抑制剂+酒精组小鼠肝细胞凋亡的数目更显着（P<0.05）。5.蛋白免疫印迹实验结果:与生理盐水+酒精组相比较,尾静脉注射ADAM9-sg RNA3+酒精组和尾静脉注射JNK抑制剂+酒精组肝内CYP2E1,Bax,TNF-α,ADAM9,α-SMA,p-c-Jun的蛋白表达量显着降低（P<0.05或P<0.01）;而VEGF,PCNA,HSP70的蛋白表达量显着升高（P<0.05或P<0.01）。结论在小鼠酒精性肝纤维化中,ADAM9起到促进肝纤维化的作用,ADAM9通过激活JNK信号通路促进小鼠酒精性肝纤维化。
李鹏宇[5]（2020）在《SMOC2在膝骨关节炎患者中的表达及骨关节炎进程中的作用研究》文中指出研究背景骨关节炎（osteoarthritis,OA）是一种累及肌肉骨骼系统,以关节软骨受损,发生病理性退变和继发性骨质增生为主要特征的退行性疾病。骨关节炎的发生源于力学和生物学因素共同作用下导致软骨细胞、细胞外软骨基质和软骨下骨质三者降解和合成平衡破坏。骨关节炎可累及全身各个关节,但以膝关节、手关节、髋关节居多。骨关节炎患者随病程进展可出现关节疼痛和功能受限,影响生活质量,严重者无法工作甚至导致残疾。根据发达国家统计显示,骨关节炎是除心血管疾病外,导致50岁以上男性人群失去工作能力的第二风险因素。失业会进一步加重患者的经济负担,导致更为严重的社会经济问题。据流行病学家统计,2017年全球有超过3亿人受到了关节炎的侵扰。我国40岁以上人群的患病率约为10-17%。关节软骨为透明软骨,主要由软骨细胞和细胞外软骨基质构成。软骨基质为关节软骨的主要组成部分,是维持软骨细胞外环境稳定、负责软骨生理功能和力学特性的物质构成基础。基质蛋白是软骨基质中的重要组分,可以与胶原结合,协助构建软骨中纤维支架网络,维持软骨的强度和稳定。此外,基质蛋白还可以作为配体与软骨细胞表面的受体结合,调节软骨细胞迁移、增殖、分化等一系列生理功能。目前研究发现在骨关节炎发生后,软骨基质蛋白可以通过调节软骨和滑膜中的信号通路从而影响炎症进程。SPARC（secreted protein acidic and rich in cysteine）家族蛋白最早是从骨骼中分离得到,又被称作骨粘连蛋白或BM-40蛋白,是目前研究最多的细胞外基质蛋白,在骨骼矿化、细胞与基质的相互作用和骨重塑等方面扮演了重要角色。SPARC家族成员之一的分泌性模块化钙结合蛋白—SMOC（SPARC related modular calcium-binding protein）包括 SMOC1 和 SMOC2 两个亚型。SMOC2 基因位于染色体6q27,在组织中广谱表达,并与骨骼发育息息相关。在胚胎期小鼠肢体中即可检测到Smoc2基因表达,并且在骨骺生长板中表达较高。SMOC2基因敲除的动物模型可出现颅面部骨骼发育异常。SMOC2基因突变的患者表现出小牙和少牙畸形。在骨祖细胞中,SMOC2的高表达可以抑制细胞的成骨分化和细胞外基质的矿化过程。本课题组在前期发现SMOC2基因突变还可导致患者出现常染色体显性遗传的多发性骨骺发育不良（multiple epiphyseal dysplasia,MED）,该遗传性骨病的标志性临床表现之一就是早发性骨关节炎。基于以上线索,我们推测在骨骼系统疾病,特别是骨关节炎的进展中,SMOC2可能发挥一定作用。软骨基质进行性降解是骨关节炎的标志性病理特征。胶原和蛋白多糖是基质的主要组成部分,可以被基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）和去整合素金属蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs,ADAMTS）降解。在骨关节炎进展中,软骨细胞合成基质分子的能力受到抑制,MMP和ADAMTS表达增高,基质合成-降解平衡遭到破坏。炎性细胞因子白介素（interleukin,IL）和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）在骨关节炎的发生发展中也扮演了重要角色。它们能抑制基质分子的表达,同时刺激蛋白酶的分泌,诱导软骨细胞凋亡,并刺激其他炎症因子的合成,从而加剧软骨的破坏。有研究报道,软骨细胞在受到某些基质蛋白刺激后,胶原和蛋白聚糖的表达降低,炎症因子和蛋白酶表达升高,从而加速了骨关节炎的进展。NF-κB通路参与了包括骨关节炎、类风湿性关节炎、哮喘、动脉粥样硬化等多种炎症和风湿性疾病的病理进程。在骨关节炎进展中,NF-κB不仅可以介导炎症因子、趋化因子、受体分子和蛋白酶等一系列促炎分子的表达,还可以调控软骨细胞增殖、凋亡的细胞周期进程,是骨关节炎药物治疗的重要靶点。有研究表明Smoc2基因敲除小鼠可以拮抗肺纤维化和肝脏脂肪变性进程中Nf-Kb激活的炎症反应,提示SMOC2可能通过激活NF-κB通路而调控炎症反应。SMOC2作为存在于关节软骨中的细胞基质蛋白,在骨骼发育和炎症反应中都发挥了重要作用,我们推测SMOC2可能参与了骨关节炎的发生发展进程。为此我们提出了以下问题:第一,SMOC2在骨关节炎患者中表达如何;第二,SMOC2在骨关节炎的病程中,是否参与了炎症进程及具体影响的分子机制。在本研究中,我们将对以上问题进行探索。研究目的1、检测SMOC2在骨关节炎软骨和正常软骨中的表达量,并探究软骨退变程度和SMOC2表达水平的关联性。2、检测SMOC2在不同人群体液中含量的差异,并探究血清中SMOC2的含量与软骨退变标志物及骨关节炎临床指标的相关性。3、探究SMOC2对软骨细胞炎症反应的影响以及在小鼠骨关节炎进程中所发挥的作用。研究方法及材料1、收集骨关节炎患者和正常人膝关节胫骨平台处软骨,提取总RNA进行实时定量PCR实验,对比骨关节炎软骨和正常软骨中SMOC2的mRNA表达量。同时对骨关节炎软骨组织包埋切片,进行HE及番红固绿染色,根据OARSI（Osteoarthritis Research Society International）评分对软骨退变进行分级。利用免疫组织化学染色观察不同分级软骨组织中SMOC2蛋白的表达,利用Image J分析组织SMOC2染色阳性程度。并分析SMOC2染色阳性程度和软骨退变OARSI分级是否具有相关性。2、收集骨关节炎患者和非退变性膝关节损伤（半月板、韧带损伤）患者的关节液,利用Elisa试剂盒检测,对比两者中SMOC2蛋白含量是否有差异。收集骨关节炎患者、非退变性膝关节损伤患者和正常体健人群的血清样本,检测不同人群血清中SMOC2蛋白含量。同时检测骨关节炎患者血清中软骨退变标志物和炎症因子的含量,并收集骨关节炎患者临床资料,将血清中SMOC2含量同临床症状评分和实验室指标做相关性分析。3、利用重组SMOC2蛋白（rhSMOC2）刺激原代小鼠软骨细胞,提取总RNA和蛋白质,采用实时定量PCR和Western blot检测软骨细胞受到SMOC2刺激后合成基质分子、炎症因子和金属蛋白酶的能力。同时通过Western blot实验检测rhSMOC2刺激后,人软骨细胞C28/I2和原代小鼠软骨细胞中NK-κB通路蛋白激活情况,并利用细胞免疫荧光染色观察P65入核情况。4、对野生型C57BL/6小鼠进行膝关节半月板不稳定手术（Distablization of Medial Meniscus,DMM）造模,诱导小鼠骨关节炎发生,取小鼠膝关节包埋切片后,采用HE和番红固绿染色检测软骨退变,免疫组化检测Smoc2表达。同时向DMM造模后小鼠的关节腔内注射rhSMOC2后对膝关节切片进行HE和番红固绿染色,观察软骨的破坏情况,并利用免疫组化检测肥大软骨细胞标志物的表达情况。研究结果第一部分SMOC2在骨关节炎患者关节软骨及体液中的表达我们收集了 28例因骨关节炎行关节置换术的患者的胫骨平台软骨,作为骨关节炎软骨,3例因车祸而行股骨髁上截肢患者的胫骨平台处软骨,作为正常软骨对照。首先提取5例骨关节炎软骨及3例正常软骨的总RNA,检测SMOC2的表达情况。结果显示,SMOC2在骨关节炎软骨中的mRNA表达高于正常软骨。之后从31例软骨标本中分离得到共41例软骨骨块,脱钙包埋切片,染色后根据OARSI分级,将软骨退变程度分为GO到G4。ImageJ计算SMOC2在软骨中表达的相对阳性程度。Spearman等级相关分析结果显示,随软骨退变程度增加,SMOC2蛋白表达升高,两者呈正相关趋势（r=0.816,p<0.001）。提示SMOC2可能在骨关节炎疾病进展中发挥一定作用。我们收集了 10例因骨关节炎行关节置换术的患者的关节液及5例因半月板或韧带损伤行关节镜手术患者的关节液进行检测。结果显示,骨关节炎患者的关节液中SMOC2含量明显高于关节镜手术患者,提示SMOC2在关节液中的含量可能随软骨受损情况加重而升高。进一步研究其在血液中表达情况。收集到38例骨关节炎患者血清（OA组）,11例半月板或韧带损伤患者血清（Non-OA组）,10例健康人群血清（Normal组）。Elisa结果显示,OA组与Non-OA组患者血清中SMOC2含量无明显差异,但两组数值均明显高于Normal组。同时收集OA组患者的其他临床及实验室指标,Spearman等级相关分析结果显示,OA组患者血清中SMOC2含量与软骨降解标志物COMP（r=0.328,p=0.045）、WOMAC骨关节炎指数（r=0.328,p=0.044）和VAS疼痛评分（r=0.366,p=0.024）正相关。多元逐步回归分析显示血清COMP含量（p=0.003）和VAS评分（p=0.004）是血清SMOC2含量升高的相关因素。这一部分结果显示血清中SMOC2含量可能与患者的临床症状存在相关性,SMOC2可能是反应骨关节炎严重程度的潜在标志物。第二部分 SMOC2促进软骨细胞炎症发生和分解代谢从新生小鼠肋软骨中分离得到原代软骨细胞进行培养,以Oμg/m1、0.1μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml 浓度递增的 rhSMOC2 刺激 24h 后提取总 RNA和蛋白质,结果显示Ⅱ型胶原（Col2a1）和蛋白聚糖（Acan）的表达随rhSMOC2浓度增高而逐渐降低,软骨细胞合成基质分子的能力受到抑制。同时软骨细胞的炎症反应增强,炎症因子IL-1β、IL-6、iNos、Cox2、趋化因子Cc15和可以直接降解软骨基质中成分的蛋白酶Mmp3、Mmp13、Adamts4表达升高,且增高的程度呈现出对rhSMOC2刺激的浓度依赖性。IL-1β的抑制剂,IL-1ra表达受到SMOC2的抑制。SMOC2可以促进软骨降解和炎症反应。为研究SMOC2与炎症通路NF-κB通路的关系,以0μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、25μg/ml浓度递增的rhSMOC2刺激人C28/I2软骨细胞系15min,30min和60min。结果显示P65磷酸化水平增高,NF-κB通路被激活。同样的激活效应在原代小鼠软骨细胞中也得到证实。进一步利用细胞免疫荧光染色发现,以浓度为1μg/ml的rhSMOC2刺激6h后,C28/I2和原代小鼠软骨细胞中P65核转位增强。SMOC2可能通过激活NF-κB通路促进骨关节炎的炎症反应。第三部分SMOC2促进小鼠骨关节炎的进程对8周龄野生型C56BL/6雄性小鼠进行DMM手术诱导骨关节炎的发生,以施假手术SHAM组作为对照,每组各5只小鼠。术后8周时处死小鼠,取小鼠膝关节包埋切片,组织学分析显示DMM组小鼠膝关节出现明显骨关节炎表现,提示造模成功。且DMM组小鼠软骨和滑膜中Smoc2的表达高于SHAM组。随后为进一步在体内验证SMOC2的促炎作用,对DMM手术诱导后的小鼠进行关节腔内注射rhSMOC2,并设置术后注射PBS的小鼠为对照组,每组各5只小鼠。术后每周注射1次,4周后处死小鼠。组织学分析显示rhSMOC2注射组的小鼠,软骨破坏增强,且肥大软骨细胞标志物X型胶原（Col10a1）和Runx2表达增强。SMOC2可以促进DMM诱导的小鼠骨关节炎进程。研究结论1、SMOC2作为软骨基质蛋白的一员,在骨关节炎软骨中表达升高,且表达水平和软骨退变程度正相关,提示SMOC2可能促进骨关节炎进展。2、SMOC2在骨关节炎患者的关节液和血清中含量升高。SMOC2在血清中的含量和软骨损伤标志物COMP、WOMAC骨关节炎指数和VAS疼痛评分正相关,血清中SMOC2含量可能在骨关节的诊断和反应疾病进展程度方面具有临床意义。3、体外和体内实验的结果表明,SMOC2可以加剧软骨基质的降解和软骨细胞的炎症反应,具体机制可能与激活NF-κB介导的炎症通路有关。SMOC2为促进骨关节炎疾病进展的促炎分子。
贾乃心[6]（2020）在《ADAM17在电场诱导表皮细胞集体定向迁移中的作用与机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景创面愈合包括表皮细胞迁移,增殖与分化,其中表皮细胞向创面中心定向迁移是创面愈合的关键步骤。近年来发现,表皮细胞是以融合的单层朝向创面中心迁移以加速创面愈合进程。表皮细胞片层向创面中心定向迁移的能力受损会导致慢性创面的形成。为了使表皮细胞片层更有效的向伤口中心迁移,我们需要明确指导细胞定向迁移的信号。创面内源性电场作为一个重要的方向信号指导表皮细胞片层有效地向创面中心进行迁移。创面内源性电场是由表皮屏障受损,跨上皮电势差消失后自发产生的,创面中心相对于创缘电势更低,成为内源性电场的负极,而创缘成为该电场的正极。在体外,电场强度为42-200 mV/mm的直流电场可诱导细胞朝正极或负极集体定向迁移,这种现象称为电趋性。有效的电趋性总是伴随着细胞极化的产生,而肌动蛋白丝（F-actin）在迁移细胞片层前缘形成的膜突起是定向迁移的主要驱动力。研究表明电场是诱导细胞极化和表皮细胞定向迁移的重要信号,然而电场指导表皮细胞集体定向迁移的分子机制尚未完全阐明。我们前期的研究表明ADAM17（解聚素金属蛋白酶17）是伤口愈合中的关键调节子:它为表皮细胞迁移建立了最初的起源,并因此激活HB-EGF/EGFR信号通路,这有助于加速创面再上皮化。在损伤的表皮中,激活ADAM17促使HB-EGF分子裂解释放,使EGFR磷酸化水平增强,促进表皮细胞迁移,此信号机制参与表皮屏障修复的调控过程。在电趋性的细胞中,EGFR被认为是调节表皮细胞电趋性迁移中一个重要的受体分子。电场以配体非依赖的方式激活EGFR,随后抑制EGFR的活性显着抑制了表皮细胞的电趋性。此外,在表皮细胞中,电场诱导EGFR和F-actin呈现出共定位且极性分布状态,且HB-EGF/EGFR通路参与F-actin极化的调控。然而ADAM17是否协助HB-EGF/EGFR信号通路在电场作用条件下诱导表皮细胞集体定向迁移,这一信号机制是否又参与电场诱导F-actin的极性分布目前依然未明确。因此本研究将根据这一思路探究ADAM17在电场调节表皮细胞集体定向迁移中的作用与机制。本研究提出“电场通过激活ADAM17,加速HB-EGF分子释放以促进EGFR磷酸化,进而调控表皮细胞的集体定向迁移,进而这一信号通路在电场诱导细胞骨架的极性分布中也发挥着重要作用”的科学假设,并通过一系列实验予以证明,研究对深入揭示ADAM17参与创面表皮细胞定向迁移的作用机制,深化对创面愈合临床治疗的探索,具有重要意义。研究内容与方法1.电场对表皮细胞集体定向迁移的影响使用外加电场诱导表皮细胞趋电性的实验模型,观察表皮单层的电趋性以及与单个细胞在不同电场强度下的电趋性。分析电场对表皮细胞单层电趋性迁移的特征以及表皮单个细胞和细胞片层电趋性迁移的差异。2.ADAM17在电场诱导表皮细胞集体定向迁移中的作用采用ADAM17活性测试试剂盒测试不同电场强度下表皮细胞片层ADAM17活性变化,免疫荧光观察电场对移行前沿表皮细胞ADAM17分布的影响;在此基础上,采用活细胞工作站观察抑制ADAM17活性或干扰ADAM17表达（ADAM17特异性抑制剂TAPI-2预处理或ADAM17-siRNA转染表皮细胞）对表皮细胞片层电趋性迁移的影响,明确ADAM17在表皮细胞片层电趋性迁移中的作用。3.ADAM17调控电场诱导的表皮细胞集体定向迁移的信号机制观察电场作用条件下表皮细胞单层HB-EGF释放、EGFR磷酸化以及EGFR分布的变化;明确抑制ADAM17活性或抑制EGFR磷酸化（EGFR特异性抑制剂AG1478）对表皮细胞片层HB-EGF释放、EGFR磷酸化与分布,以及细胞电趋性迁移的影响;观察外源性重组HB-EGF对ADAM17-si RNA预处理表皮细胞片层EGFR磷酸化和电趋性的影响,揭示HB-EGF/EGFR信号通路在ADAM17调节表皮细胞单层电趋性迁移中的作用。4.ADAM17/HB-EGF/EGFR信号通路对电场诱导F-actin极性分布的影响采用免疫荧光方法,观察电场作用条件下移行前沿表皮细胞F-actin分布的变化;在此基础上,明确干扰ADAM17表达或抑制EGFR磷酸化对电场诱导移行前沿细胞F-actin分布变化的影响。观察外源性补充重组HB-EGF对ADAM17-si RNA预处理表皮细胞片层F-actin极性变化,揭示ADAM17/HB-EGF/EGFR信号通路在电场诱导细胞骨架F-actin极性分布中的重要作用。结果1.电场促进表皮细胞单层朝向电场正极方向定向迁移,且迁移的方向性和速度呈电场强度依赖性。与单个表皮细胞相比,表皮细胞单层呈现出更高效的电趋性响应特征。2.电场促进ADAM17以电场强度依赖的方式活化,且诱导ADAM17聚集于朝向正极的移行前沿表皮细胞的伪足部分,呈现极性分布特征。抑制ADAM17活性或沉默ADAM17表达均显着抑制了表皮细胞单层的电趋性特征。3.在电场作用条件下,表皮细胞单层HB-EGF释放增加、EGFR磷酸化增强且聚集于朝向正极的移行前沿表皮细胞的伪足部分,也即EGFR呈现极性分布特征。抑制ADAM17活性或沉默ADAM17表达可显着抑制电场诱导的HB-EGF释放、EGFR磷酸化及其极性分布。抑制EGFR显着抑制表皮细胞片层的电趋性迁移。外源性补充重组HB-EGF可逆转ADAM17沉默导致的EGFR磷酸化以及表皮细胞片层电趋性受抑。4.电场诱导F-actin聚集于朝向正极的移行前沿表皮细胞的伪足部分,也即电场作用条件下F-actin发生极性分布,这一极性分布现象可被ADAM17-siRNA和EGFR抑制剂所抑制。外源性补充重组HB-EGF可逆转ADAM17-siRNA对F-actin分布的影响,使F-actin又呈现出极性分布特征。结论综上所述,我们的研究表明,电场是诱导表皮细胞片层集体定向迁移的重要因素。ADAM17活化并极性分布于移行前沿细胞伪足,上调局部HB-EGF/EGER信号,进而诱发细胞微丝骨架F-actin极性重排,是电场诱导表皮细胞集体定向迁移的重要机制。研究为促进创面愈合提供了新的调控靶点。
关艳杰[7]（2020）在《中重度宫腔粘连病因及治疗研究进展》文中指出宫腔粘连对女性生殖功能影响严重,为目前女性继发不孕常见病因之一。目前国内一些学者研究方向集中在宫腔粘连病因中的高危因素、临床治疗学的手术及药物上,而中重度宫腔粘连患者普遍存在治疗效果较差、治疗后再复发率高的现象,成为临床工作中遇到的棘手问题。结合国内外相关文献,从分子学及组织学角度对宫腔粘连的病因及治疗研究进展做以探讨,以期为中重度宫腔粘连的治疗、减少复发及提高妊娠率,开拓新思路。
唐庆华[8]（2019）在《冷刀分离宫腔粘连术后妊娠结局相关因素的分析》文中研究表明研究目的:通过收集临床数据,了解冷刀分离宫腔粘连的效果,并分析与冷刀分离宫腔粘连术后患者妊娠结局相关的因素,从而为判断有生育要求的宫腔粘连患者使用冷刀技术治疗后妊娠结局良好与否提供依据。研究内容:选取东南大学附属中大医院妇科2013年5月至2017年10月期间使用HEOS冷刀技术治疗的宫腔粘连患者,回顾性分析其临床资料,包括年龄、病程、粘连程度、防粘连措施等,并电话随访其术后月经情况及妊娠结局。采用SPSS18.0统计软件对可能影响妊娠结局的相关因素进行单因素和多因素Logistic回归分析。研究结果:1、一般情况:本研究共纳入158例宫腔粘连患者,平均年龄为（31.32±4.30）岁,冷刀分离宫腔粘连术后月经改善率为80.3%,总妊娠率为60.1%,活产率为55.8%。2、术后复查情况:轻度粘连的患者术后1-3月宫腔镜复查时再粘连率为14.3%,中度粘连的患者为28.6%,重度粘连的患者为65.2%,粘连程度与术后复查再粘连率之间有统计学意义（P<0.05）。3、各因素与妊娠结局之间的关系:病程、术后月经、粘连范围、粘连类型、粘连程度、再粘连与冷刀分离宫腔粘连术后妊娠结局之间有统计学意义（P<0.05）;年龄、宫腔操作次数、术前月经、是否曾电切、防粘连装置与术后妊娠结局之间无统计学意义（P>0.05）。再粘连是影响患者术后妊娠的独立危险因素。4、是否曾电切与再粘连之间的关系:患者行冷刀分离宫腔粘连前曾行电切分离粘连的有18例,再粘连13例（72.2%）,未行电切分离粘连的有140例,再粘连45例（32.1%）,是否曾电切与再粘连之间有统计学意义（P<0.05）。研究结论:1、冷刀分离宫腔粘连可以明显改善患者的术后月经情况,以及提高妊娠率和活产率。2、冷刀治疗轻度粘连和中度粘连的效果较好,但治疗重度粘连的效果欠佳。3、病程、术后月经、粘连范围、粘连类型、粘连程度、再粘连是影响冷刀分离粘连后妊娠结局的主要因素。4、电切分离宫腔粘连可能增加术后再粘连发生的机率。5、冷刀作为一种对子宫内膜和宫腔环境损伤很小的手术方式,可能成为有生育要求的宫腔粘连患者的首要选择。
云昕矞[9]（2019）在《干扰型表达载体rAd-col2A1-shRNA-ADAM8/EGFR转染大鼠关节炎模型的实验研究》文中进行了进一步梳理目的:在分子实验的基础上,从动物整体水平上评估shADAM8及shEGFR在关节软骨损伤及修复上的治疗作用,验证靶向抑制ADAM8及EGFR改善软骨退变的分子机制,为下一步关节炎治疗奠定药物基础。方法:1.关节炎模型建立2.转染大鼠关节炎模型（1）正常关节组:不予特殊处理（2）单纯碘乙酸（空白对照组）:关节腔内注入0.2ml 0.9%Nacl溶液（3）rAd-col2A1-shRNA-ADAM8干扰组;造模后右后侧膝关节腔内注射1.6×108pfu/ml rAd-col2A1-shRNA-ADAM8重组腺病毒0.2ml。（4）rAd-col2A1-shRNA-EGFR干扰组;造模后右后侧膝关节腔内注射1.6×108pfu/ml rAd-col2A1-shRNA-EGFR重组腺病毒0.2ml。（5）空病毒注射组（阴性对照组）;照模后右后侧膝关节腔内注射1.6×108pfu/ml腺病毒空载体0.2ml3.指标检测:（1）一般情况观察;动物生命体征,生活习惯和有无步态改变,观察切口愈合情况,有无红肿、感染。（2）大体标本观察;膝关节囊有无痉挛、粘连和新生物形成;滑膜有无充血、水肿和滑液增多;软骨有无侵蚀、关节面边缘有无骨赘形成、半月板损伤等骨性关节炎改变;修复组织的平整性、光泽度、颜色和周围组织的结合情况。（3）病理学检查;通过苏木精-伊红（hematoxylin-eosin staining,HE）染色,观察滑膜及软骨组织学形态,是否被炎症细胞浸润;通过番红0-固绿染色及甲苯胺蓝染色观察软骨细胞形态及骨关节炎的病理学机制;通过免疫组化染色（Immunohistochemistry,IHE）观察CollagenⅡ、Aggrecan及MMP-9的表达。（4）QPCR检测:基因水平用QPCR检测,分析ADAM8、EGFR、MMP-9、CollagenⅡ、Aggrecan表达情况,并分析它们之间的关系,验证shADAM8及shEGFR改善软骨退变的分子机制,通过SPSS1 9.0软件进行分析,采用单因素方差分析比较各组之间的差异,以P<0.05分析是否具有统计学意义。结果:骨关节炎的病理学机制是细胞外基质的降解大于合成,给药组与空白对照组相比,ADAM8、EGFR、MMP-9水平均较空白对照组低,Arrencan和CollagenⅡ水平均升高且有统计学意义（P<0.05）。结论:1.本实验在骨关节炎模型中,ADAM8、EGFR、MMP-9的表达增高,并与骨关节炎的严重程度成正相关,其结果与分子实验相符合。2.本实验在动物模型上验证了前期分子实验所发现的新的通路,ADAM8的所产生的配体与EGFR相结合通过p38 MAPK通道进而调节MMP-9的产生,从而对细胞外基质产生降解,引起软骨细胞的凋亡。3.抑制ADAM8或EGFR可以延缓骨关节炎的产生
段欠欠[10]（2019）在《分泌型去整合素金属蛋白酶ADAM12S促进小细胞肺癌细胞增殖和转移的分子机制研究》文中研究表明去整合素金属蛋白酶 12（A Disintegrin And Metalloproteinase 12,ADAM12）是去整合素蛋白酶家族的一员,具有典型的蛋白水解酶功能。它有两种构型:穿膜全长型ADAM12L和分泌型ADAM12S。研究发现,ADAM12在小细胞肺癌（Small cell lung cancer,SCLC）组织中高表达,在SCLC患者的血清和尿液中显着高于正常人,并与SCLC患者的生存率呈负相关。ADAM12S可以促进SCLC细胞的增殖、迁移和侵袭,但其具体作用机制尚不清楚。本论文旨在寻找ADAM12S在SCLC细胞中调控的蛋白以及潜在水解底物,以期阐明其促进SCLC细胞增殖和转移的分子机制。第一部分定量蛋白组学和生化方法发现ADAM12S促进SCLC细胞增殖和转移的新机制目的:在SCLC细胞株中对ADAM12S调控的蛋白进行系统的鉴定,寻找ADAM12S影响SCLC细胞增殖和转移的关键蛋白。方法:qRT-PCR方法检测不同SCLC细胞株中ADAM12S的mRNA水平,筛选出低表达和高表达的细胞株;利用慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreenl构建ADAM12S过表达质粒,包装慢病毒、侵染ADAM12S低表达的H1688细胞株,利用流式细胞分选仪筛选稳定表达ADAM12S/ZsGreen和ZsGreen对照细胞株;CCK-8细胞增殖实验、划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验研究ADAM12S对H1688细胞增殖和转移的影响:采用细胞培养稳定同位素标记氨基酸（Stable isotope labeling by amino acids in cell culture,SILAC）技术标记对照组和ADAM12S过表达组细胞,用Orbitrap质谱仪分析酶解的多肽组份,用蛋白质分析软件MaxQuant搜索数据库鉴定蛋白质,根据SILAC标记获得各个蛋白质在两个样品中的相对丰度,获得SCLC细胞中ADAM12S过表达后显着变化的蛋白;利用DAVID数据库分析ADAM12S调控的蛋白,分析ADAM12S所参与的生物学功能以及胞内信号通路;Western Blotting（WB）验证质谱获得的差异较大且与细胞增殖、迁移和侵袭相关的调控蛋白;qRT-PCR方法验证质谱鉴定上调的Ⅰ型己糖激酶（Hexokinase I,HK1）的mRNA水平;WB方法检测HK1转录因子c-Myc的蛋白水平以及上游通路Akt/ERK的蛋白和磷酸化水平;在高表达ADAM12S的细胞株中用siRNA敲低ADAM12S观察HK1的变化;siRNA敲低HK1后观察ADAM12S对细胞增殖、迁移和侵袭的影响;构建敲低HK1的shRNA慢病毒质粒,在稳定过表达ADAM12S的H1688细胞株中敲低HK1,进行克隆形成实验;同时在shRNA稳定敲低HK1的细胞株中检测细胞的乳酸代谢和葡萄糖摄取能力。研究结果:通过三次生物学重复和定量分析共鉴定到了 70个ADAM12S调控的蛋白,并对这些调控蛋白进行生物学功能分析,发现其中许多蛋白参与三羧酸循环、糖异生、糖酵解等代谢途径。生物化学方法验证了微囊蛋白1（Caveolin-1,CAV1）、半胱氨酸甘氨酸丰富蛋白1（Cysteine and glycine-rich protein 1,CSRP1）、膜联蛋白A6（Annexin A6,ANXA6）、谷氨酸草酰乙酸转氨酶 1（Aspartate aminotransferase,GOT1）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（Glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase,G6PD）以及HK1等蛋白与ADAM12S的调控关系,与质谱结果一致,均被ADAM12S上调。在多种与代谢相关的蛋白中,发现糖酵解途径关键限速酶HK1与肿瘤的发生发展密切相关。在H1688细胞株中过表达ADAM12S后,HK1 amRNA水平和蛋白水平均显着上调,而HK2没有上调趋势;在H446细胞中敲低ADAM12S,HK1蛋白水平下调;乳酸代谢和葡萄糖摄取实验结果显示,过表达ADAM12S,乳酸代谢和葡萄糖摄取均上调,但敲低HK1后,上调作用被明显抑制。增殖、迁移和侵袭实验表明,当敲低HK1后,ADM12S引起的增殖、迁移和侵袭均下降,而且ADAM12S对克隆形成的促进作用也被显着抑制。我们还发现ADAM12S可以上调HK1的转录因子c-Myc的mRNA水平以及蛋白水平;我们检测了 c-Myc上游的Akt和ERK通路,发现ADAM 12S上调Akt的磷酸化水平。研究结论:通过SILAC定量蛋白质组学方法在SCLC细胞中共鉴定了 70种ADAM12S调控的蛋白;并且通过生物化学方法证实部分蛋白与ADAM12S的调控关系。ADAM12S通过上调HK1,促进SCLC细胞的增殖、迁移、侵袭以及克隆形成,激活HK1依赖的有氧糖酵解。同时,ADAM12S可能是通过PI3K/Akt/c-Myc途径影响HK1的表达,进而影响SCLC细胞的增殖和转移。第二部分SPECS方法在分泌蛋白组中鉴定ADAM12S调控糖蛋白目的:在SCLC细胞的分泌蛋白组中对ADAM12S调控的蛋白进行系统的鉴定,以期寻找影响SCLC细胞增殖和转移的糖蛋白,并期望从中鉴定到ADAM12S潜在的水解底物。方法:本课题中采用点击糖富集分泌组蛋白（Secretome protein enrichment with click sugars,SPECS）方法富集培养基上清中的糖蛋白。用Ac4ManNAz培养细胞,将叠氮标记到糖蛋白分子上,通过分泌或切割方式释放到培养基上清中。收集培养基上清,超滤浓缩收集蛋白,将未参加反应的Ac4ManNAz滤去,将叠氮标记的糖蛋白与Sulfo-DBCO-Biotin进行点击化学反应,将生物素标记到糖蛋白分子上,超滤除去多余的Sulfo-DBCO-Biotin分子。收集超滤管中的糖蛋白,利用NeutrAvidin与生物素的强亲和力纯化糖蛋白。我们首先优化了该方法的多个实验步骤,然后进行大样品富集,对纯化的蛋白样品进行电泳分离及银染检测,切胶后进行胶内酶解,酶解多肽经C18 ZipTip除盐后,进行LC-MS/MS分析。将得到的原始质谱数据用Proteome Discoverer进行非标记定量蛋白质组学分析,获得ADAM12S在分泌蛋白组中调控的蛋白。研究结果:优化了 SPECS方法,并通过三次SPECS生物学重复和定量分析方法在SCLC细胞上清中鉴定到了 ADAM12S显着调控的67种分泌蛋白和膜蛋白,预测其中有17种是ADAM12S潜在的水解底物,如腓骨蛋白2（Fibulin-2,FBLN2）、生长分化因子 6（Growth differentiation factor 6,GDF6）、维生素 K 依赖蛋白 C（Vitamin K-dependent protein C,PROC）、分泌型磷蛋白 1（Secreted phosphoprotein-1,SPP1）、黑色素瘤细胞黏附分子（Melanoma cell adhesion molecule,MCAM,又名 CD146）等。我们对质谱数据中变化较大的SPP1以及CD146进行了深入分析,发现ADAM12S切割SPP1和CD146对于肿瘤的增殖和转移具有重要的生物学意义。研究结论:优化了 SPECS方法,并成功富集了 SCLC细胞分泌蛋白组的糖蛋白,鉴定了 17种ADAM12S潜在的水解底物。既推进了 SPECS方法在分泌蛋白组学中的应用,也为ADAM12S的生物学功能研究提供了前期的研究基础。
二、解离素-金属蛋白酶蛋白家族的基础与临床意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、解离素-金属蛋白酶蛋白家族的基础与临床意义（论文提纲范文）
（1）解离素-金属蛋白酶17在恶性胸腔积液中的变化及其临床应用价值的研究（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 1.1 资料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 标本采集 |
| 1.2.2 样本测定 |
| 1.3统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 一般资料 |
| 2.2 良、恶性胸腔积液中ADAM17的表达情况 |
| 2.3 ADAM17的诊断效能以及与CEA、CYFRA21-13种指标联合的诊断ROC曲线 |
| 2.4 ADAM17与各指标的相关分析 |
| 3 讨论 |
（2）蛇毒研究进展:从致命毒素到新药开发（论文提纲范文）
| 1 蛇毒主要组分 |
| 1.1 蛇毒主要酶类 |
| 1.1.1 蛇毒金属蛋白酶(snake venom metalloprotein‐ases,SVMPs) |
| 1.1.2 蛇毒磷脂酶A2 (snake venom PLA2s,sv PLA2s) |
| 1.1.3 蛇毒透明质酸酶 |
| 1.2 蛇毒多肽 |
| 1.2.1 3FTxs |
| 1.2.2 蛇毒解离素 |
| 2 蛇毒毒性效应及其解毒策略 |
| 3 蛇毒药理活性及其应用 |
| 3.1 抗肿瘤作用 |
| 3.2 抗神经退行性疾病 |
| 3.3 抗心血管疾病 |
| 3.4 抗炎、抗菌及免疫调节作用 |
| 3.5 镇痛作用 |
| 3.6 抗病毒活性 |
| 4 结语与展望 |
（3）粪类圆线虫Ss-ast-1虾青素金属蛋白酶编码基因的鉴定与表达分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1.文献综述 |
| 1.1 粪类圆线虫简介 |
| 1.1.1 粪类圆线虫概述 |
| 1.1.2 粪类圆线虫的生活史 |
| 1.1.3 粪类圆线虫的流行病学 |
| 1.1.4 粪类圆线虫病的临床症状和病理变化 |
| 1.1.5 粪类圆线虫病的诊断方法和治疗措施 |
| 1.2 .虾青素金属蛋白酶 |
| 1.2.1 金属蛋白酶概述 |
| 1.2.2 虾青素金属蛋白酶概述 |
| 1.2.3 虾青素金属蛋白酶研究进展 |
| 1.3 显微注射在寄生虫基因功能研究中的应用 |
| 2.研究目的与意义 |
| 3.材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物以及实验用菌株、载体 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.2 实验溶液的配制 |
| 3.2.1 抗生素和培养基的制备 |
| 3.2.2 琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)主要溶液 |
| 3.2.4 Western blot缓冲液 |
| 3.2.5 线虫收集用缓冲液 |
| 3.2.6 ELISA试验相关溶液 |
| 3.2.7 镍柱亲和纯化缓冲液 |
| 3.2.8 酶活实验缓冲液 |
| 3.2.9 其它缓冲液 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 粪类圆线虫的保存和各阶段虫体的收集及感染方法 |
| 3.3.2 引物的设计与合成 |
| 3.3.3 粪类圆线虫DNA的提取 |
| 3.3.4 粪类圆线虫RNA的提取 |
| 3.3.5 反转录获得粪类圆线虫cDNA的提取 |
| 3.3.6 粪类圆线虫Ss-ast-1的生物信息学分析 |
| 3.3.7 粪类圆线虫Ss-ast-1全长和截短型原核表达质粒的构建 |
| 3.3.7.1 Ss-ast-1 全长基因的PCR扩增(p ET-42b-no GST载体) |
| 3.3.7.2 Ss-ast-1 全长基因的PCR扩增(p E-SUMO载体) |
| 3.3.7.3 Ss-ast-1 截短基因的PCR扩增(p E-SUMO载体) |
| 3.3.7.4 PCR产物的凝胶检测 |
| 3.3.7.5 PCR产物的凝胶纯化回收 |
| 3.3.7.6 目的DNA连接p ET-42b-no GST与 p E-SUMO载体 |
| 3.3.7.7 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 3.3.7.8 连接产物的转化 |
| 3.3.7.9 菌液PCR鉴定 |
| 3.3.8 粪类圆线虫Ss-AST-1重组蛋白的小量表达 |
| 3.3.9 粪类圆线虫Ss-AST-1 重组蛋白的SDS-PAGE检测 |
| 3.3.10 粪类圆线虫Ss-AST-1重组蛋白的大量表达 |
| 3.3.11 包涵体的溶解 |
| 3.3.12 粪类圆线虫Ss-AST-1重组蛋白的纯化 |
| 3.3.13 粪类圆线虫Ss-AST-1重组蛋白的复性 |
| 3.3.14 粪类圆线虫Ss-AST-1 重组蛋白的Western-Blot分析 |
| 3.3.15 多克隆抗体的制备 |
| 3.3.16 ELISA测定多抗血清效价 |
| 3.3.17 粪类圆线虫全虫蛋白的提取 |
| 3.3.18 Western blot多克隆抗体的特异性 |
| 3.3.19 粪类圆线虫Ss-AST-1蛋白的酶活性实验 |
| 3.3.20 粪类圆线虫Ss-ast-1定位质粒的构建 |
| 3.3.21 粪类圆线虫的转基因实验 |
| 3.3.22 粪类圆线虫转基因后代的观察 |
| 4.结果与分析 |
| 4.1 选定研究基因 |
| 4.1.1 从转录组数据中筛选锌依赖性金属蛋白酶的基因 |
| 4.1.2 构建进化树选定粪类圆线虫靶基因 |
| 4.2 粪类圆线虫Ss-ast-1基因的生物信息学分析 |
| 4.2.1 粪类圆线虫Ss-ast-1蛋白的氨基酸进化树 |
| 4.2.2 粪类圆线虫Ss-ast-1基因的氨基酸比对分析 |
| 4.2.3 粪类圆线虫Ss-AST-1抗原性和亲水性分析 |
| 4.2.4 粪类圆线虫Ss-ast-1 基因的DNA结构分析 |
| 4.2.5 粪类圆线虫Ss-AST-1蛋白的三维结构分析 |
| 4.3 粪类圆线虫Ss-ast-1基因在各个时期的转录水平分析 |
| 4.4 粪类圆线虫Ss-AST-1蛋白信号肽位置分析 |
| 4.5 原核表达质粒的构建和鉴定 |
| 4.5.1 全长蛋白原核表达质粒Ss-AST-1-p ET-42b-no GST-qc的构建 |
| 4.5.2 全长原核表达质粒Ss-AST-1-p E-SUMO-qc的构建 |
| 4.5.3 Ss-AST-1 截短型原核表达质粒Ss-AST-1-p E-SUMO-jd的构建 |
| 4.6 粪类圆线虫全长和截短型Ss-AST-1的原核表达 |
| 4.6.1 以Ss-AST-1-p ET-42b-no GST-qc质粒表达全长Ss-AST-1 |
| 4.6.1.1 Ss-AST-1 的诱导表达(Ss-AST-1-p ET-42b-no GST-qc) |
| 4.6.1.2 不同浓度IPTG对全长Ss-AST-1 蛋白表达的影响 |
| 4.6.1.3 全长Ss-AST-1蛋白在包涵体和上清中的表达情况 |
| 4.6.2 .以Ss-AST-1-p E-SUMO-qc质粒表达全长Ss-AST-1 |
| 4.6.3 截短型Ss-AST-1的原核表达 |
| 4.6.4 蛋白的纯化 |
| 4.6.5 蛋白的复性 |
| 4.6.6 复性蛋白的Western blot分析 |
| 4.7 酶谱法检测酶活性 |
| 4.8 多克隆抗体的制备 |
| 4.8.1 ELISA测定抗血清效价 |
| 4.8.2 多克隆抗体的Western blot分析 |
| 4.9 粪类圆线虫Ss-ast-1的基因定位 |
| 4.9.1 粪类圆线虫Ss-ast-1基因启动子序列分析 |
| 4.9.2 粪类圆线虫Ss-ast-1定位质粒的构建 |
| 4.9.3 粪类圆线虫Ss-ast-1在虫卵中的表达模式 |
| 5.讨论 |
| 5.1 粪类圆线虫Ss-AST-1的一级结构和三维结构分析 |
| 5.2 粪类圆线虫Ss-AST-1的原核蛋白的表达和纯化 |
| 5.3 粪类圆线虫Ss-AST-1的酶活性的分析 |
| 5.4 粪类圆线虫Ss-ast-1的转录水平的分析 |
| 5.5 粪类圆线虫Ss-AST-1的定位分析 |
| 6.结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 |
| 附录2 |
（4）ADAM9在酒精性肝纤维化中的作用及调控的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 酒精性肝纤维化概述 |
| 1.1.1 酒精性肝纤维化病因及发病机制 |
| 1.1.2 酒精性肝纤维化病理特点 |
| 1.1.3 酒精性肝纤维化动物模型 |
| 1.2 酒精性肝纤维化过程中分子调控机制研究 |
| 1.2.1 酒精及其代谢产物对肝脏的影响 |
| 1.2.2 CYP2E1与酒精性肝纤维化 |
| 1.2.3 热休克蛋白与酒精性肝纤维化 |
| 1.2.4 细胞凋亡与酒精性肝纤维化 |
| 1.2.5 c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号途径与酒精性肝纤维化 |
| 1.3 解整合素-金属蛋白酶ADAM9 |
| 1.3.1 ADAM9概述 |
| 1.4 CRISPR/Cas9 技术概述 |
| 1.4.1 CRISPR/Cas9 系统的发展历程及分类 |
| 1.4.2 CRISPR/Cas9 系统的结构 |
| 1.4.3 CRISPR/Cas9 系统的实验原理 |
| 1.4.4 CRISPR/Cas9 系统在各个方面的应用 |
| 第2章 前言 |
| 第3章 材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞和质粒 |
| 3.1.2 实验动物准备 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 主要实验试剂 |
| 3.1.5 主要试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 实验设计 |
| 3.2.2 利用CRISPR/Cas9 技术构建ADAM9 三合一质粒 |
| 3.2.3 细菌培养 |
| 3.2.4 提取质粒 |
| 3.2.5 细胞培养 |
| 3.2.6 筛选HSC-T6细胞最佳嘌呤酶素浓度 |
| 3.2.7 嘌呤酶素筛选和细胞转染 |
| 3.2.8 PCR技术检测 |
| 3.2.9 胶回收DNA |
| 3.3 体外实验 |
| 3.3.1 免疫印迹蛋白检测 |
| 3.4 体内实验 |
| 3.4.1 血清AST、ALT酶活性的检测 |
| 3.4.2 组织包埋及切片 |
| 3.4.3 HE染色检测各组小鼠的肝脏坏死情况 |
| 3.4.4 苦味酸-天狼星红染色法检测各组小鼠肝脏纤维化的情况 |
| 3.4.5 Hoechst33258 染色法检测小鼠的肝细胞凋亡状况 |
| 3.4.6 免疫印迹蛋白检测 |
| 3.5 实验数据的统计学分析 |
| 第4章 结果 |
| 4.1 CRISPR/Cas9 技术靶向突变小鼠ADAM9 基因三合一质粒 |
| 4.2 免疫印迹法检测细胞蛋白表达结果 |
| 4.3 小鼠血清ALT、AST酶活性的检测结果 |
| 4.4 肝脏组织HE染色结果 |
| 4.5 肝脏组织苦味酸-天狼星红染色结果 |
| 4.6 肝脏组织Hoechst33258 染色结果 |
| 4.7 免疫印迹法检测组织蛋白的表达结果 |
| 第5章 讨论 |
| 5.1 小鼠酒精性肝纤维化中ADAM9与转氨酶和组织损伤的关系 |
| 5.2 小鼠酒精性肝纤维化中ADAM9和胶原纤维的关系 |
| 5.3 小鼠酒精性肝纤维化中ADAM9 和α-SMA的关系 |
| 5.4 小鼠酒精性肝纤维化中ADAM9和细胞凋亡的关系 |
| 5.5 小鼠酒精性肝纤维化中ADAM9 对肝细胞应激分子HSP70 的影响 |
| 5.6 小鼠酒精性肝损伤中ADAM9对肝细胞增殖的作用 |
| 5.7 小鼠酒精性肝纤维化中ADAM9和VEGF的关系 |
| 5.8 小鼠酒精性肝纤维化中ADAM9和JNK信号途径的关系 |
| 5.9 小鼠酒精性肝纤维化中ADAM9和CYP2E1 的关系 |
| 5.10 小鼠酒精性肝纤维化中ADAM9和TNF-α的关系 |
| 5.11 问题与展望 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略语词汇表 |
| 附录 Ⅰ 图及说明 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（5）SMOC2在膝骨关节炎患者中的表达及骨关节炎进程中的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 SMOC2在骨关节炎患者关节软骨及体液中的表达 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 SMOC2促进软骨细胞炎症发生和分解代谢 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 SMOC2促进小鼠骨关节炎的进程 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 文献综述 |
| 综述一 骨关节炎的研究进展 |
| 综述二 SMOC家族基因的研究历史及现状 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 附件 |
| 英文论文 |
（6）ADAM17在电场诱导表皮细胞集体定向迁移中的作用与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 文献综述 ADAM17调节表皮细胞迁移的分子机制 |
| 1.皮肤创面愈合过程 |
| 2.ADAM17在调控表皮细胞迁移中的作用 |
| 3.ADAM17在调控表皮细胞迁移中的作用机制 |
| 引言 |
| 第1章 电场对表皮细胞集体定向迁移的影响 |
| 1.1 材料方法 |
| 1.1.1 主要仪器、试剂及材料 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.1.3 实验分组 |
| 1.1.4 实验数据统计学处理 |
| 1.2 实验结果 |
| 1.2.1 电场指导表皮细胞向正极集体定向迁移 |
| 1.2.2 表皮细胞向正极集体定向迁移与电场强度正相关 |
| 1.2.3 与单细胞电趋性相比,表皮细胞单层呈现出更高效的电趋性响应特征 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 ADAM17在电场诱导表皮细胞集体定向迁移中的作用 |
| 2.1 材料方法 |
| 2.1.1 主要仪器、试剂及材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 实验分组 |
| 2.1.4 实验数据统计学处理 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 电场促进ADAM17 活化并诱导ADAM17 朝正极极性分布 |
| 2.2.2 转染ADAM17-si RNA对表皮细胞ADAM17 表达和分布的作用 |
| 2.2.3 抑制ADAM17活性或下调ADAM17表达对HaCaT细胞单层电趋性的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 ADAM17调控表皮细胞单层集体定向迁移的信号机制 |
| 3.1 材料方法 |
| 3.1.1 主要仪器、试剂及材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.3 实验分组 |
| 3.1.4 实验数据统计学处理 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 电场促进EGFR磷酸化 |
| 3.2.2 ADAM17 促进电场诱导EGFR磷酸化过程 |
| 3.2.3 ADAM17 促进电场诱导EGFR朝正极极性分布 |
| 3.2.4 抑制EGFR磷酸化显着抑制表皮细胞片层集体定向迁移 |
| 3.2.5 电场主要促进HB-EGF分子释放 |
| 3.2.6 ADAM17 在电场促进HB-EGF释放中起促进作用 |
| 3.2.7 HB-EGF介导ADAM17 在电场作用下诱导EGFR磷酸化过程 |
| 3.2.8 HB-EGF在 ADAM17/EGFR通路调节表皮细胞集体定向迁移 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 ADAM17/HB-EGF/EGFR信号通路在电场诱导F-actin极性分布中的作用 |
| 4.1 材料方法 |
| 4.1.1 主要仪器、试剂及材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.1.3 实验分组 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 电场诱导表皮细胞骨架F-actin极性分布于移行前沿细胞伪足 |
| 4.2.2 ADAM17 在电场诱导F-actin极性分布中的作用 |
| 4.2.3 HB-EGF/EGFR通路在ADAM17 调节F-actin极性分布中的作用 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间发表的文章 |
（7）中重度宫腔粘连病因及治疗研究进展（论文提纲范文）
| 1 IUA病因 |
| 1.1 临床病因 |
| 1.2 组织学病因 |
| 1.3 分子学病因 |
| 1.3.1 转化生长因子（Transforming growth factor-1, TGF-β1) : |
| 1.3.2 细胞外基质降解相关因子金属蛋白酶9 (Matrix metalloproteinases 9, MMP-9) : |
| 1.3.3 解聚素金属蛋白酶 (ADAMs) : |
| 1.3.4 金属蛋白酶组织抑制分子 (Tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMP) : |
| 1.3.5 叉头框F2 (FoxF2) : |
| 1.3.6 赖氨酰氧化酶 (Lysyloxidase, LOX) : |
| 1.3.7 内皮生长因子-1 (IGF-1) : |
| 2 IUA治疗 |
| 2.1 药物治疗 |
| 2.1.1 雌激素: |
| 2.1.2 血管扩张剂: |
| 2.1.3 孕激素及维生素E: |
| 2.2 干细胞治疗 |
| 2.2.1 人子宫内膜干细胞 (Human endometrialstem cells, hEDSCs) : |
| 2.2.2 胚胎干细胞 (Embryonic stem cells, ESC) : |
| 2.2.3 骨髓干细胞 (Bone mesenchymal stem cells, BM-SCs) : |
| 2.2.4 多功能干细胞 (Induced pluripotent stem cells, IPS) : |
| 2.3 组织工程学生物材料 |
| 2.3.1 羊膜: |
| 2.3.2 膀胱黏膜层基底膜 (UBM) : |
| 3 结语 |
（8）冷刀分离宫腔粘连术后妊娠结局相关因素的分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词注释表 |
| 前言 |
| 文献综述 宫腔粘连中相关因子的表达及其治疗进展 |
| 一、宫腔粘连中相关因子的表达 |
| 1、促进纤维组织形成的因子 |
| 2、影响子宫内膜修复的因子 |
| 3、其他因子或分子 |
| 二、宫腔粘连的治疗进展 |
| 1.手术方式的选择 |
| 2.术后预防再粘连的治疗 |
| 三、小结 |
| 第一章 研究方法 |
| 1.1 概要 |
| 1.2 技术路线 |
| 1.3 研究对象 |
| 1.4 研究内容 |
| 第二章 结果与讨论 |
| 2.1 一般情况 |
| 2.2 术后复查情况 |
| 2.3 影响冷刀分离宫腔粘连术后妊娠的单因素分析 |
| 2.4 影响冷刀分离宫腔粘连术后妊娠的多因素分析 |
| 2.5 是否曾电切与再粘连之间的关系 |
| 2.6 讨论 |
| 第三章 结论 |
| 第四章 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（9）干扰型表达载体rAd-col2A1-shRNA-ADAM8/EGFR转染大鼠关节炎模型的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（10）分泌型去整合素金属蛋白酶ADAM12S促进小细胞肺癌细胞增殖和转移的分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1. 小细胞肺癌 |
| 2. ADAMs和ADAM12及其与疾病的关联 |
| 3. ADAM 12和小细胞肺癌 |
| 4. 科学问题的提出和本课题的研究目的 |
| 第二章 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 1. 细胞株 |
| 2. 质粒 |
| 3. 仪器 |
| 4. 抗体 |
| 5. 细胞生物学试剂 |
| 6. 分子克隆及PCR试剂 |
| 7. 免疫印迹、银染 |
| 8. 质谱试剂 |
| 9. 溶液配制 |
| 二、实验方法 |
| 1. 细胞实验 |
| 2. 荧光定量聚合酶链式反应(qRT PCR) |
| 3. 克隆实验 |
| 4. 免疫印迹实验 |
| 5. 银染 |
| 6. 点击糖富集分泌组蛋白(SPECS) |
| 7. 细胞培养稳定同位素标记氨基酸(SILAC)技术 |
| 8. LC-MS/MS |
| 9. 质谱数据分析 |
| 10. 统计学分析 |
| 第三章 定量蛋白组学和生化方法发现ADAM12S促进SCLC细胞增殖和转移的新机制 |
| 一、引言 |
| 二、结果 |
| 1. 构建稳定过表达zsGreen和ADAM12S的细胞株 |
| 2. ADAM12S促进小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭 |
| 3. 定量蛋白质组学鉴定小细胞肺癌细胞中ADAM12S调控的蛋白 |
| 4. ADAM12S调控的蛋白的生物信息学分析 |
| 5. 生化方法验证质谱鉴定的ADAM12S调控的蛋白 |
| 6. 质谱图揭示ADAM12S上调HK1蛋白水平 |
| 7. ADAM12S通过HK1促进SCLC细胞的增殖、迁移和侵袭 |
| 8. shHK1慢病毒质粒构建以及敲低效率验证 |
| 9. ADAM12S通过上调HK1促进SCLC细胞的克隆形成 |
| 10. ADAM12S上调HK1依赖的有氧糖酵解 |
| 11. ADAM12S上调HK1的mRNA水平以及两者mRNA水平相关性 |
| 12. ADAM12S可能通过Akt信号通路调节HK1依赖的糖酵解 |
| 三、讨论 |
| 第四章 SPECS方法在分泌蛋白组中鉴定ADAM12S调控的糖蛋白 |
| 一、引言 |
| 二、结果 |
| 1. 细胞代谢标记Ac_4ManNAz条件的优化 |
| 2. Sulfo-DBCO-Biotin生物素标记实验条件的优化 |
| 3. 糖蛋白纯化条件优化 |
| 4. SPECS质谱鉴定样品的准备 |
| 5. 非定量蛋白质组学鉴定ADAM12S调控的糖蛋白 |
| 6. ADAM12S潜在水解底物SPP1和CD146分析 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 综述ADAMS家族对肿瘤形成和发展的作用 |
| 1. ADAMs家族的结构特点和功能 |
| 2. 影响肿瘤细胞形成和发展的途径和机制 |
| 3. ADAMs与肿瘤的诊断、治疗和预后 |
| 4. 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 中英文缩略词表 |
| 攻读博士学位期间的科研成果 |
| 致谢 |
四、解离素-金属蛋白酶蛋白家族的基础与临床意义（论文参考文献）
- [1]解离素-金属蛋白酶17在恶性胸腔积液中的变化及其临床应用价值的研究[J]. 陈明,陈小鹤,杨守杭,陈帆. 中国卫生检验杂志, 2022(02)
- [2]蛇毒研究进展:从致命毒素到新药开发[J]. 董德刚,王万春,邓中平. 药学学报, 2020(09)
- [3]粪类圆线虫Ss-ast-1虾青素金属蛋白酶编码基因的鉴定与表达分析[D]. 单嘉男. 华中农业大学, 2020(02)
- [4]ADAM9在酒精性肝纤维化中的作用及调控的分子机制研究[D]. 宋晓改. 河南科技大学, 2020(06)
- [5]SMOC2在膝骨关节炎患者中的表达及骨关节炎进程中的作用研究[D]. 李鹏宇. 山东大学, 2020(09)
- [6]ADAM17在电场诱导表皮细胞集体定向迁移中的作用与机制研究[D]. 贾乃心. 西南大学, 2020(01)
- [7]中重度宫腔粘连病因及治疗研究进展[J]. 关艳杰. 陕西医学杂志, 2020(02)
- [8]冷刀分离宫腔粘连术后妊娠结局相关因素的分析[D]. 唐庆华. 东南大学, 2019(05)
- [9]干扰型表达载体rAd-col2A1-shRNA-ADAM8/EGFR转染大鼠关节炎模型的实验研究[D]. 云昕矞. 内蒙古医科大学, 2019(03)
- [10]分泌型去整合素金属蛋白酶ADAM12S促进小细胞肺癌细胞增殖和转移的分子机制研究[D]. 段欠欠. 苏州大学, 2019(04)