一、Influence of anti-TNFα Monocolonal Antibody on Intestinal Barrier in Rats with Acute Pancreatitis（论文文献综述）
GAO Qiang,HAN Zhen-Yun,TIAN Dan-Feng,LIU Gan-Lu,WANG Zhen-Yi,LIN Jing-Feng,CHANG Ze,ZHANG Dan-Dan,XIE Ying-Zhen,SUN Yi-Kun,YAO Xing-Wei,MA Da-Yong[1]（2021）在《Xinglou Chengqi Decoction improves neurological function in experimental stroke mice as evidenced by gut microbiota analysis and network pharmacology》文中进行了进一步梳理The current study was designed to explore the brain protection mechanism of Xinglou Chengqi Decoction（XCD）based on gut microbiota analysis and network pharmacology. A transient middle cerebral artery occlusion（MCAO） model of mice was established, followed by behavioral evaluation, TTC and TUNEL staining. Additionally, to investigate the effects of gut microbiota on neurological function after stroke, C57BL/6 mice were treated with anti-biotic cocktails 14 days prior to ischemic stroke（IS） to deplete the gut microbiota. High-throughput 16S rDNA gene sequencing, metabonomics technique, and flow multifactor technology were used to analyze bacterial communities, SCFAs and inflammatory cytokines respectively. Finally, as a supplement, network pharmacology and molecular docking were applied to fully explore the multicomponent-multitarget-multichannel mechanism of XCD in treating IS, implicated in ADME screening, target identification, network analysis, functional annotation, and pathway enrichment analysis.We found that XCD effectively improved neurological function, relieved cerebral infarction and decreased the neuronal apoptosis.Moreover, XCD promoted the release of anti-inflammatory factor like IL-10, while down-regulating pro-inflammatory factors such as TNF-α, IL-17A, and IL-22. Furthermore, XCD significantly increased the levels of short chain fatty acids（SCFAs）, especially butyric acid. The mechanism might be related to the regulation of SCFAs-producing bacteria like Verrucomicrobia and Akkermansia, and bacteria that regulate inflammation like Paraprevotella, Roseburia, Streptophyta and Enterococcu. Finally, in the network pharmacological analysis, 51 active compounds in XCD and 44 intersection targets of IS and XCD were selected. As a validation, components in XCD docked well with key targets. It was obviously that biological processes were mainly involved in the regulation of apoptotic process, inflammatory response, response to fatty acid, and regulation of establishment of endothelial barrier in GO enrichment. XCD can improve neurological function in experimental stroke mice, partly due to the regulation of gut microbiota. Besises, XCD has the characteristic of "multi-component, multi-target and multi-channel" in the treatment of IS revealed by network pharmacology and molecular docking.
刘胜伟[2]（2021）在《基于转录组学的β-石竹烯抗脑缺血再灌注损伤的机制研究》文中指出
沙洲[3]（2021）在《松花粉多糖对鸡肠道黏膜免疫的影响及巨噬细胞的免疫调节作用》文中进行了进一步梳理松花粉作为传统医学中的膳食补充剂已有数百年历史,而具有广泛生物学活性的多糖（Polysaccharides,PS）是松花粉的关键活性成分之一,已经被运用到改善和调节免疫功能等方面。黏膜免疫系统是动物（尤其是家禽）整个免疫网络的重要组成部分,也是抵抗外源抗原感染的第一道防线。肠道黏膜是食物消化和营养吸收的关键部位,其中存在的肠道微生物和大量免疫细胞共同形成坚固的防御屏障,而作为免疫细胞的巨噬细胞（Macrophages,m（?））具有趋化性运动、吞噬、分泌和抗原呈递等功能,在抗感染、抗肿瘤、免疫调节等过程中扮演积极角色。本论文以从山东省泰安市的松花粉中分离纯化的松花粉多糖（Pine pollen Polysaccharides,PPPS）作为研究对象,运用分子生物学等技术在体内探究PPPS对肠道黏膜免疫的影响;通过16S高通量测序分析PPPS对肠道内菌群结构丰度的作用;在体外以鸡巨噬细胞（HD11）作为靶细胞,揭示PPPS对其的免疫调节作用并初步探究作用机制。本研究旨在为研制对黏膜免疫具有免疫增强作用的新型免疫增强制剂提供实验基础和理论依据。主要研究内容和结果如下:1、PPPS对黏膜免疫的影响本试验首先选取120只1日龄的SPF鸡,随机分为PBS组、PPPS低剂量组（LPPPS组）、PPPS中剂量组（MPPPS组）、PPPS高剂量组（HPPPS组）,分别口服PBS和3种不同剂量的PPPS（10 mg/m L,20 mg/m L和40 mg/m L）,0.2 m L/只,持续21天。在试验的第7、14和21天分别收集各组鸡的肠道组织、粪便及血液样品。通过ELISA方法、流式细胞术、CCK-8试剂、实时荧光定量PCR（q PCR）等技术分别检测免疫学相关指标,主要包括:SIg A和Ig G抗体水平、CD4+、CD8+T淋巴细胞水平、T淋巴细胞转化率、细胞因子（白介素2、白介素4、干扰素γ）、黏膜免疫相关分子基因（CD80、CD86、MHC-I、MHC-II）。结果表明PPPS显着提高鸡的黏膜抗体SIg A和血清抗体Ig G水平,并有效促进细胞因子分泌及T淋巴细胞水平,上调黏膜免疫相关基因m RNA水平。通过HE染色观察PPPS对小肠绒毛结构的影响,分别采集PBS组及PPPS组鸡的小肠不同部位组织制成石蜡切片,测量并统计分析各组鸡的十二指肠、空肠和回肠绒毛长度、宽度、隐窝深度及V/C值（长度/深度）的变化。结果表明,PPPS能有效改善小肠绒毛发育以增强肠道黏膜抵御病原体的物理屏障。为了探究PPPS对肠道黏膜的保护作用,试验的第21天,分别对每组鸡滴鼻100μL106TCID50新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）病毒液,记录攻毒后体重变化及死亡率,并取各段小肠及肺脏采用HE染色观察病理变化,通过q PCR检测肠黏膜病毒载量。结果表明,MPPPS、HPPPS组与LPPPS、PBS组相比,显着减轻由NDV引起的体重降低、病理损伤、病毒载量及死亡率。另外通过感染H9N2病毒探究口服PPPS对呼吸道黏膜的保护作用,在口服40 mg/m L的PPPS剂量7天后,PBS组及PPPS组选取5只鸡分别滴鼻100μL 104TCID50H9N2病毒液,在攻毒后第3、5和7天采集肺脏组织HE染色,通过q PCR检测肺脏病毒量,采用免疫荧光对病毒进行定位并分析荧光强度。结果表明PPPS显着降低肺脏中病毒量,减轻肺脏病理变化。证明PPPS不仅能有效保护肠道黏膜损伤,同样对呼吸道黏膜也具有保护作用。2、PPPS对肠道菌群的影响为了探究PPPS对鸡肠道菌群的影响,在口服PPPS的第21天,收集PBS组及HPPPS组（40 mg/m L）鸡粪便样本,通过16S高通量测序对鸡肠道菌群组成、多样性等方面进行分析研究。结果表明,PBS组与PPPS组的肠道菌群组成存在较大差异,通过Venn图结果表明,PPPS组OTU值显着升高。在门水平上分析,PPPS组的Firmicutes（厚壁菌门）、Bacteroidetes（拟杆菌门）、Proteobacteria（变形菌门）与PBS组相比均有较大变化。在科水平上分析,Lactobacillaceae（乳杆菌科）、Bacteroidaceae（拟杆菌科）、Lachnospiraceae（毛螺菌科）、Rikenellaceae（理研菌科）变化较为明显。在属水平上分析,PPPS组与PBS组相比,诸如Enterococcus（肠球菌）、Bacteroides（拟杆菌属）、Alistipes（别样杆菌属）、Helicobacter（螺杆菌属）、Intestinimonas（瘤胃菌属）等均丰度上升。在种水平上分析,Lactobacillus＿reuteri（罗伊氏乳杆菌）,Enterococcus＿cecorum（盲肠链球菌）、Bacteroides＿uniformis、Bacteroides＿thetaiotaomicro（拟杆菌）,Lachnospiraceae＿bacterium＿615、Lachnospiraceae＿bacterium＿M18-1（毛螺菌）,Clostridium＿sp＿AUH-JLC140（梭状杆菌）,Alistipes＿finegoldii（别样杆菌）等丰度上升。在α多样性及UPGMA聚类树等分析发现,PPPS组的菌群物种多样性显着高于PBS组。因此说明PPPS能够改善肠道菌群结构及丰富度。3、PPPS对巨噬细胞的免疫调节作用为了探究PPPS对巨噬细胞HD11的免疫调节作用,首先用CCK-8试剂检测不同浓度的PPPS对HD11细胞的增殖作用,通过中性红及FITC-葡聚糖分析PPPS对HD11细胞的吞噬活性的影响,Griess试剂检测PPPS处理HD11细胞后分泌一氧化氮（NO）水平,荧光探针法测定活性氧（ROS）,ELISA法检测HD11细胞培养液上清液中白介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）含量。通过q PCR法检测诱导型一氧化氮合酶（i NOS）、IL-1β和TNF-α的m RNA水平变化。结果表明,当PPPS浓度高于800μg/m L时,PPPS对HD11细胞增殖具有一定的抑制作用,而在低于400μg/m L时能显着促进增殖效果。因此选用50-400μg/m L浓度范围的PPPS进行后续试验。中性红及FITC-葡聚糖试验显示PPPS均能显着提高HD11细胞吞噬活性,但各浓度间的作用效果无显着差异。PPPS以剂量依赖性方式促进HD11细胞分泌NO、IL-1β、TNF-α,且上调i NOS、IL-1β、TNF-αm RNA水平。通过高通量测序技术,对以200μg/m L PPPS处理24 h的HD11细胞与PBS组细胞进行转录组测序,分析比较差异表达m RNA、mi RNA及信号通路。结果表明,PPPS组有2358个上调表达基因和2028个下调表达基因,其中富集分析与免疫相关主要通路为内吞作用、黏附连接、内质网蛋白质加工、细胞因子-细胞因子受体相互作用、转运蛋白、Toll样受体、MAPK、Notch、C型凝集素受体、NOD样受体、RIG-I样受体等信号通路。mi RNA结果显示10个mi RNA在PPPS组中高表达,21个mi RNA下调表达。KEGG通路富集分析主要通路为内吞作用、紧密连接、溶酶体、黏合连接、细胞粘附分子、内质网蛋白加工、Notch等信号通路。为了探究PPPS作用的HD11细胞的受体以及免疫调节的信号通路,根据转录组结果,我们选择分析验证Toll样受体、MAPK、NF-κB分子对HD11细胞的影响。在PPPS处理HD11细胞后,通过q PCR方法检测Toll样受体2、4（TLR 2、4）、甘露糖受体（MR）和NF-κB分子m RNA水平。TLR4、MAPK三种亚基（p38、JNK、ERK1/2）和NF-κB抑制剂预处理细胞后,Griess法检测NO水平、ELISA法检测IL-1β和TNF-α的分泌量。结果表明,PPPS在不同时间点均上调细胞表面受体TLR4和NF-κB的m RNA水平,证明TLR4是PPPS激活HD11细胞的重要受体,NF-κB是PPPS促进HD11细胞活化的关键核因子。TLR4、MAPK、NF-κB抑制剂均能显着降低HD11细胞NO、IL-1β和TNF-α的分泌量,说明TLR4、MAPK、NF-κB均参与PPPS对HD11细胞的免疫增强作用。结果表明PPPS通过TLR4/MAPK/NF-κB信号通路激活HD11细胞产生免疫应答。综上所述,PPPS显着促进肠道黏膜免疫功能及小肠绒毛发育,有效减轻由NDV和H9N2引发的肠道及肺脏组织病理损伤,改善肠道菌群丰度且通过TLR4/MAPK/NF-κB信号通路激活HD11细胞。本课题不仅探究PPPS对鸡黏膜免疫及肠道菌群的影响,而且揭示了对巨噬细胞的免疫调节作用。因此,PPPS作为天然免疫增强剂具有良好的开发潜力和应用前景。
周莹[4]（2021）在《氨暴露下肠道菌群在肉鸡呼吸道与肠道炎症的作用机制研究》文中指出氨（NH3）会影响呼吸道健康,但是肠道菌群在氨暴露引起的呼吸道与肠道健康中的作用及途径尚不清楚,本研究主要分以下三个部分开展相关研究:试验一:不同浓度氨暴露对肉鸡呼吸道和肠道炎症因子与菌群的影响试验选取288只雄性AA肉鸡,随机分成4组,每组6个重复,每个重复12只鸡,分别暴露于0、15、25和35 ppm的氨暴露处理中,试验持续21天。研究发现,和对照组相比,氨浓度的增加显着升高细胞因子IL-1β、IL-6和IL-10的含量（P<0.05）。且气管和回肠中上述细胞因子含量均呈显着正相关（P<0.05）。随着氨浓度的增加,会显着增加呼吸道和肠道中有害菌的数目,降低有益菌的数目。呼吸道和肠道中一些关键菌属随氨浓度增加变化趋势相似。结果表明,不同浓度氨暴露下呼吸道和肠道炎症和菌群的变化有关系。试验二:氨暴露下肠道菌群在肉鸡呼吸道与肠道炎症的潜在作用机制研究试验选取144只雄性AA肉鸡,随机分成2组,每组6个重复,每个重复12只鸡,分别暴露于对照组（0 ppm）和处理组35 ppm氨暴露中,试验持续21天。研究发现,氨暴露引起呼吸道和肠道屏障破坏。氨暴露下肠中muc2、claudin-1、IL-6和IL-10下降,而TLR4、My D88、NF-κB、TNF-α、IL-1β和caspase3的显着增加。氨暴露降低呼吸道连接蛋白,升高muc5ac、TLR4、My D88、NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和caspase3的表达量。氨暴露导致肠道菌群中厚壁菌门减少、变形菌门和拟杆菌门的增加,属水平上的Streptococcus,Escherichia-Shigella,Faecalibacterium,[Ruminococcus]＿torques＿group,Ruminococcaceae＿UCG-014,unclassified＿f＿Lachnospiraceae,Rothia,unclassified＿f＿Ruminococcaceae显着增加。显着改变的上述肠道菌属与呼吸道和肠道中TLR4和TNF-α呈显着正相关。结果表明,TLR4/TNF-α信号通路可能是氨暴露下肠道菌群导致呼吸道和肠道炎症的重要调节机制。试验三:氨暴露下肠道菌群通过TLR4/TNF-α信号通路引起肠道和呼吸道的炎症损伤为了验证上述通路,我们进行了抗生素消除肠道菌群和菌群移植两个试验。1)30只肉鸡从氨暴露前3周开始,在饲料中添加抗生素混合物,直至采样。2)取氨暴露下肉鸡的回肠内容物取上清液,移植到健康肉鸡。发现,菌群移植引起受体肉鸡肠道和呼吸道损伤,增加肠道和呼吸道中的TLR4和TNF-α浓度。此外,抗生素处理减弱了氨引起的肠道和呼吸道损伤,减少了TLR4和TNF-α浓度。对照组和氨暴露组、菌群移植组和PBS组、氨暴露组和抗生素处理组、菌群移植组和氨暴露组、PBS组和对照组,这五组处理组之间呼吸道差异菌群分析发现,肠道菌群的改变会影响氨暴露下呼吸道菌群的组成。结论,TLR4/TNF-α信号通路是氨暴露下肠道菌群导致呼吸道和肠道炎症损伤的重要调节机制。[Ruminococcus]＿torques＿group是氨暴露下肠道菌群与呼吸道损伤的重要关联菌。
高瑞娟[5]（2021）在《蒙药“巴布-7”对大肠杆菌性腹泻小鼠肠黏膜屏障保护机制的相关研究》文中研究指明大肠杆菌性腹泻是致死率较高的一种传染病,造成严重畜牧业经济损失。蒙药巴布-7（Babu seven compound,BBS）对腹泻有较强的临床疗效。但BBS对大肠杆菌性腹泻肠道屏障功能的研究较少。为研究BBS对大肠杆菌性腹泻肠道屏障功能的影响。本研究开展如下实验:实验1:为建立大肠杆菌性腹泻模型,将90只小鼠分为空白对照组（VG,口腔灌服生理盐水,n=10）,模型Ⅰ组（MGⅠ,腹腔注射1.0×109CFU/m L E.coli O1,n=20）,模型Ⅱ组,（MGⅡ,口腔灌服1.0×109CFU/m L E.coli O1,n=20）,模型Ⅲ组,（MGⅢ,单次口腔灌服2%Na HCO3和1.0×109CFU/m L E.coli O1,n=20）,模型Ⅳ组,（MGⅣ连续1次/3 d口腔灌服2%Na HCO3和1.0×109CFU/m L E.coli O1,n=20）,攻毒后连续观察7 d,观察小鼠腹泻率、死亡率、DAI评分、肠道病变并检测炎性因子。结果表明,MGⅠ小鼠出现腹泻症状,死亡率达75%。MGⅡ小鼠未见异常;MGⅢ小鼠腹泻率达60%,死亡率达15%,腹泻症状于攻毒24 h后自愈。MGⅣ小鼠腹泻率达65%,死亡率达15%,存活小鼠腹泻、精神萎靡、厌食等症状可以持续72 h以上,且肠道病理变化和炎性因子均显着高于正常对照组。结果显示,连续3 d（1次/d）灌服2%碳酸氢钠溶液和1.0×109CFU/m L的致病性E.coli O1可以成功建立小鼠腹泻模型。实验2:为研究蒙药BB对大肠杆菌性腹泻小鼠肠黏膜生物屏障的影响。采用16S rDNA测序技术对小鼠盲肠微生物进行测序。通过α多样性和β多样性来综合分析BBS对大肠杆菌性腹泻小鼠肠黏膜屏障的影响。结果显示,E.coli O1入侵会降低Chao1、Ace、Shannon指数（P<0.05）,升高Simpson指数（P<0.05）,而BBS和EM治疗会升高Chao1、Ace、Shannon指数,降低Simpson指数（P<0.05）。E.coli O1的入侵会降低肠道菌群的多样性和丰富度及拟杆菌门、拟杆菌目、拟杆菌属、疣微菌门、疣微菌目、乳杆菌目、乳杆菌属的相对丰度（P<0.05）;升高拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、梭菌属、梭菌目、肠杆菌目、肠球菌属的相对丰度（P<0.05）。而BBS-H和Em-H治疗可以可以恢复菌群结构并增加有益菌丰度,降低有害菌丰度。说明,蒙药BBS-H和Em-H可以修复致病性E.coli O1造成的肠生物屏障损伤。实验3:为研究BBS对大肠杆菌性腹泻小鼠肠黏膜机械屏障影响。将125只小鼠分为9组,分别为正常对照组（VG,n=10）、模型组（MG,n=10）、阳性对照组（CG,n=15）、蒙药巴布-7高、中、低剂量组（BBS-H,BBS-M,BBS-L,n=15）、大黄素高、中、低剂量组（Em-H,Em-M,Em-L,n=15）。灌胃治疗7 d,于第8 d杀死小鼠,采集样本。光镜观察小鼠肠道病理损伤并计算绒腺比（Villus height/Crypt depth,V/C）;透射电镜观察小鼠肠道超微结构;RT-PCR、免疫组化、Western blot检测Claudin-1、Occludin、ZO-1、MLCK、JAMA的基因及蛋白表达量;ELISA法检测小鼠血清中DAO、D-LA、ET含量。结果显示:MG各肠段肠绒毛断裂,炎性细胞浸润、V/C比值降低（P<0.05）,紧密连接相关蛋白Claudin-1、Occludin、ZO-1、MLCK、JAMA表达下降（P<0.05）,血清中DAO、D-LA、ET含量显着升高（P<0.05）。而蒙药BBS-H组和Em-H组可以缓解肠道损伤（P<0.05）,提高V/C值及紧密连接相关蛋白表达量（P<0.05）,降低血清中DAO、D-LA、ET含量。表明,蒙药BBS-H和Em-H可以通过提高紧密连接相关蛋白的表达来降低肠黏膜通透性,从而来修复致病性E.coli O1造成的肠道机械屏障损伤（P<0.05）。实验4:为研究BBS对大肠杆菌性腹泻小鼠肠黏膜免疫屏障影响。流式细胞术检测CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD19+B细胞和TH1、TH2细胞百分含量并计算CD4+/CD8+比值;ELISA法检测小鼠十二指肠中免疫相关细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、TGF-β、IL-17、IL-23、SIg A含量,血清中免疫球蛋白Ig M、Ig G、lg A含量。结果显示,MG中CD3+T、CD4+T、CD19+B的百分比及CD4+/CD8+比值显着降低（P<0.05）,IL-1β、IL-6、IL-8、NO、TNF-α、IL-17、IL-23显着升高（P<0.05）,IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、TGF-β、SIg A、Ig M、Ig G、lg A显着降低（P<0.05）。蒙药BBS-H和Em-H治疗可提高CD3+T、CD4+T、CD19+B的百分比及CD4+/CD8+的比值（P<0.05）,降低IL-1β、IL-6、IL-8、NO、TNF-α、IL-17、IL-23含量（P<0.05）,提高IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、TGF-β、SIg A、Ig M、Ig G、lg A含量（P<0.05）。表明,蒙药BBS-H和Em-H可以修复大肠杆菌造成的免疫屏障损伤。实验5:为研究BBS对大肠杆菌性腹泻小鼠肠黏膜化学屏障影响。PAS染色观察肠上皮杯状细胞;免疫荧光法检测小鼠十二指肠中MUC-2含量;ELISA法检测小鼠十二指肠中肠三叶因子、溶菌酶、二糖酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶活力。结果显示,致病性E.coli O1降低杯状细胞数量及MUC-2、TFF3含量,减弱溶菌酶、二糖酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶活力（P<0.05）,蒙药BBS-H和Em-H治疗可以显着提高杯状细胞数量及MUC-2、TFF3含量,提高溶菌酶、二糖酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶活力（P<0.05）。表明,蒙药BBS-H和Em-H可以修复致病性E.coli O1造成的肠化学屏障损伤。
李兆东[6]（2021）在《万通筋骨片对类风湿关节炎的抗炎机制研究及16S rDNA高通量测序和代谢组学分析》文中研究指明类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种慢性自身免疫性疾病,具有致残率高,治疗周期长,预后差和易复发等特点,常给患者家属和社会带来沉重负担。成纤维样滑膜细胞（rheumatoid arthritis-fibroblast-like synoviocytes,RAFLSs）是关节滑膜组织的重要组成细胞,其过度增殖可促进免疫细胞释放大量促炎因子,从而引发炎症反应,加剧RA病理进程。此外,关节腔内募集的促炎因子也会进一步激活RA-FLSs细胞。因此,抑制RA-FLSs细胞增殖或降低关节内促炎因子水平是治疗RA的一种有效手段。当前,药物治疗仍是RA的主要治疗方式,但由于化学合成药物的治疗不仅费用昂贵,且常伴有副作用,因此人们正积极寻找安全、有效和廉价的药物来治疗RA。近年来,中药以其具有的显着疗效和较少的副作用,在治疗RA方面已受到越来越多的关注。此外,中药可通过多成分、多途径、多靶点的方式参与RA的治疗过程。万通筋骨片是由25味中药组成的复方药,具有“祛风散寒、通络止痛”的功效,主要用于风湿和类风湿性关节炎等骨性疾病。由于其作用机理不明确,从而限制了它在国内外的推广和使用。因此,系统研究万通筋骨片在治疗RA中的作用和机制十分必要。首先,基于胶原诱导性关节炎（collagen-induced rheumatoid arthritis,CIA）大鼠模型,我们研究万通筋骨片对RA的抗炎作用;其次,基于RA-FLSs细胞的生物学活性,我们研究万通筋骨片对RA的抗炎机制;随后,在万通筋骨片抗炎作用的基础上,我们利用高通量测序技术继续挖掘万通筋骨片的抗炎基因靶点;最后,我们利用16S rDNA高通量测序和代谢组学分析研究万通筋骨片对肠道菌群和血清代谢物谱的影响,拟挖掘参与万通筋骨片抗炎作用的靶点微生物群和靶点代谢物。因此,本研究不仅为万通筋骨片在临床上治疗RA提供了实验依据,促进了其推广和应用,而且也为中药治疗RA的机制研究建立了新的思路。第一部分万通筋骨片对类风湿关节炎的抗炎作用首先,为了确定万通筋骨片的安全给药浓度,我们进行了急性毒性实验,血常规检测和肝脾肾功能分析。其次,为了评估CIA大鼠模型的构建效果,我们检测了大鼠的足趾肿胀度,关节内TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子水平,关节的病理结构变化,以及滑膜组织中FLSs特异性标志蛋白（Vimentin）的表达水平。最后,为了研究万通筋骨片对RA的抗炎作用,我们连续灌胃给药14天和28天后,检测了CIA大鼠足趾肿胀度,炎性关节病理结构变化,以及关节腔和关节组织中TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子水平。结果显示:万通筋骨片给药的安全有效浓度可设为150、300和600 mg/kg;CIA大鼠成模率>99.00%。当连续治疗14天时,各组CIA大鼠足趾肿胀度没有明显变化;当连续治疗28天时,300和600 mg/kg组的CIA大鼠足趾肿胀度明显降低。组织病理切片显示,连续给药14天和28天时,各组CIA大鼠的关节病理结构发生不同程度的改善,尤以600 mg/kg连续给药28天的治疗组CIA大鼠,病理结构改善效果最佳。关节腔内促炎因子的水平变化结果显示,在连续给药14天和28天时,各给药浓度均表现出不同程度的抗炎作用,尤以600 mg/kg连续给药28天的抗炎效果最佳。关节组织中促炎因子的水平变化结果显示,连续给药14天时,TNF-α和IL-1β促炎因子水平显着降低;连续给药28天时,TNF-α,IL-1β和IL-6促炎因子水平明显下调。这些结果说明,万通筋骨片对RA具有抗炎作用,且呈现一定的时间依赖性和浓度依赖性。第二部分万通筋骨片在类风湿关节炎中的抗炎机制基于万通筋骨片的抗炎作用,本研究在细胞水平和动物水平继续研究万通筋骨片的抗炎机制。首先,为了确定万通筋骨片对RA-FLSs细胞增殖的影响,我们观察了RA-FLSs细胞形态变化,并应用乳酸脱氢酶活性测定,Ed U核酸标记以及免疫组化等实验技术检测RA-FLSs细胞数目变化和滑膜组织中Vimentin蛋白表达情况。其次,我们利用蛋白免疫印迹,免疫荧光和免疫组化等技术检测了MEK、p MEK、ERK1/2和p ERK1/2蛋白在RA-FLSs细胞及CIA大鼠滑膜组织中的表达水平。同时,我们还利用ERK1/2质粒转染等相关实验,进一步验证MEK/ERK信号通路在万通筋骨片抗炎过程的作用。最后,为了研究万通筋骨片是否通过诱导滑膜细胞凋亡的方式参与抗炎作用,我们检测了RA-FLSs细胞中caspase-3/9蛋白酶活性,cleaved-caspase-3和cleaved-PARP的蛋白表达水平,以及CIA大鼠滑膜组织中Bax,Bcl-2,caspase-3和cleaved-caspase-3蛋白表达水平。结果显示:药物处理24 h和48 h后,各组RA-FLSs细胞形态均发生改变,尤以3 mg/ml和4 mg/ml药物浓度处理48 h,细胞形态变化较为明显。药物处理24 h后,各组RA-FLSs细胞数目无明显变化;药物处理48 h后,2 mg/ml、3mg/ml、4 mg/ml给药浓度可以显着抑制RA-FLSs细胞增殖。经药物处理24 h和48 h后,MEK,p MEK,ERK1/2和p ERK1/2蛋白在RA-FLSs细胞中均呈现不同程度的降低趋势,尤以3 mg/ml和4 mg/ml药物浓度处理48 h,各蛋白表达差异最为明显。同时,过表达ERK1/2显着提升RA-FLSs细胞的增殖能力,而过表达ERK1/2的RA-FLSs细胞经3 mg/ml药物浓度处理后,细胞增值能力显着下降。同时,万通筋骨片可以下调MEK,p MEK,ERK1/2和p ERK1/2蛋白在滑膜组织中的表达。此外,药物处理24 h后,4 mg/ml药物浓度显着提高RA-FLSs细胞中caspase-3/9蛋白酶活性;药物处理48 h后,3 mg/ml和4 mg/ml明显上调caspase-3/9蛋白酶活性。我们还发现,药物处理24 h和48 h后,3 mg/ml和4mg/ml药物浓度显着上调cleaved-caspase-3蛋白表达,2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml药物浓度显着上调cleaved-PARP蛋白表达。同时,万通筋骨片可以上调滑膜组织中Bax和cleaved-caspase-3蛋白表达以及下调Bcl-2和caspase-3蛋白表达。这些结果表明,万通筋骨片通过抑制RA-FLSs细胞增殖及诱导RA-FLSs细胞凋亡参与抗炎过程。第三部分基于RNA高通量测序挖掘万通筋骨片在类风湿关节炎中的抗炎靶点基于万通筋骨片对RA-FLSs细胞的影响,本研究针对药物处理后的RA-FLSs细胞进行RNA高通量测序分析。为了更加全面、准确的获得抗炎靶点,我们采用两种不同的分析方法进行筛选,即DESeq2差异分析以及STEM时间序列和WGCNA权重共表达联合分析。DESeq2差异分析:通过DESeq2差异分析,拟筛选不同组别间的差异基因;针对这些差异基因,我们随后进行功能富集过滤和蛋白互作（protein-protein interaction,PPI）网络分析,并根据PPI网络中节点连接度筛选备用核心基因。STEM时间序列和WGCNA权重共表达联合分析:基于药物处理组和未处理组之间的差异基因,我们拟筛选与时间序列具有相同表达趋势的基因。针对这些基因,我们进一步筛选具有相同表达模式的差异基因。随后通过功能富集过滤,权重共表达网络分析,PPI网络分析,以及节点连接度来筛选备用核心基因。最后,我们利用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹验证备用核心基因的表达模式,以便获得理想的抗炎靶点。结果显示:通过DESeq2差异分析,在不同比较组间,我们共获得184个差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）,且这些基因与细胞周期和同源重组等代谢通路密切相关。同时,基于PPI蛋白网络,我们共筛选出4个备选核心基因,即BRCA1,ATR,SMC3和BUB1。通过STEM时间序列和WGCNA权重共表达联合分析,我们共获得111个具有相同表达趋势和表达模式的DEGs,且这些基因显着富集于细胞周期和RNA转运等代谢通路。同时,基于WGCNA和PPI网络,我们共筛选出6个备选核心基因,即PNN,SMC3,EIF3A,BUB1,ATR和ORC4。此外,TTK,STAG2和THOC1也与细胞周期密切相关,因此TTK,STAG2和THOC1也作为备选核心基因。至此,共获得10个备选核心基因,即:BRCA1、ORC4、TTK、BUB1、SMC3、ATR、PNN、EIF3A、STAG2和THOC1。基因和蛋白验证结果显示,只有SMC3和BUB1的表达模式与测序结果一致。这些结果表明,SMC3和BUB1可能是万通筋骨片在RA中的抗炎靶点。第四部分基于16S高通量测序和代谢组学联合分析挖掘万通筋骨片在类风湿关节炎中的抗炎靶点基于万通筋骨片对CIA大鼠的抗炎作用,本研究针对CIA大鼠粪便样本和血清样本,分别进行16S高通量测序分析和代谢组学分析,拟挖掘万通筋骨片抗炎作用的肠道菌群靶点和代谢物靶点。16S高通量测序分析:基于操作单元聚类和物种多样性分析,我们拟研究万通筋骨片对肠道菌群结构的影响;基于肠道菌群差异分析,我们拟筛选相对丰度较高的差异菌群。代谢组学分析:基于样本相关性和多元统计分析,我们拟研究万通筋骨片对血清代谢物谱的影响;基于差异代谢物筛选,功能富集过滤和差异代谢物表达分析,我们拟筛选理想的差异代谢物。16S高通量测序与代谢组学联合分析:基于top10差异肠道菌属和top20差异代谢物,我们进行联合分析,拟研究肠道微生物群与血清代谢物的关系,并验证或筛选肠道菌群靶点和代谢物靶点。结果显示:通过16S高通量测序分析,我们发现万通筋骨片可以明显改变CIA大鼠的肠道菌群结构。在门水平上,拟杆菌、软壁菌和脱铁杆菌的菌群相对丰度得到显着改善。此外,拟杆菌与厚壁菌的菌群相对丰度比值（Bacteroidetes/Firmicutes）也恢复到正常水平。在属水平上,弧菌、巨型球菌和漫游球菌的菌群相对丰度下调至正常水平。通过代谢组学分析,我们发现万通筋骨片可以明显改变CIA大鼠的血清代谢物谱。其中,血清素、二硫化谷胱甘肽、N-乙酰神经氨酸、萘和血栓素B2等5种代谢物均有标准化的趋势,但不具有统计学差异。通过16S高通量测序与代谢组学联合分析,我们发现,弧菌、巨型球菌和漫游球菌都存在于top10差异肠道菌群范围内,且与这3种微生物群存在显着联系的代谢物包括5种。此外,考虑到代谢物鉴定过程中的假阳性,我们认为:在这5种代谢物中,只有微管素B是内源性代谢物。这些结果表明,万通筋骨片可能通过调节肠道菌群结构和血清代谢物谱发挥抗炎作用,且弧菌、巨型球菌和漫游球菌可能是万通筋骨片的抗炎靶点菌群;微管素B可能是万通筋骨片的抗炎靶点代谢物。
窦丹丹[7]（2021）在《缩宫素通过PI3K/AKT信号通路调节树突状细胞功能缓解实验性结肠炎的机制研究》文中提出炎症性肠病（Inflammatoryboweldisease,IBD）是一种病因不明的非特异性的慢性肠道炎症性疾病,主要包括（Ulcerativecolitis,UC）和克罗恩病（Crohn’s disease,CD）。该疾病在西方国家的患病率很高,过去十年在我国迅速发展。由于迄今为止,对该病的病理机制尚不明确,故仍缺乏有效治疗方法,易复发,给患者造成巨大负担。今年来,多有学者认为IBD与免疫异常有关。缩宫素（Oxytocin,OXT）是一种经典的神经肽类激素,主要由下丘脑产生,在垂体后叶释放。OXT通过激活其受体（Oxytocin Receptor,OXTR）在哺乳动物分娩、泌乳、母婴连结以及社会交往中起到重要的生理作用。既往研究中,我们和其他实验室证实OXT及OXTR在肠道神经元中表达,其在内脏痛传导中发挥调节功能。最近我们发现OXT能够缓解DSS诱导小鼠结肠炎。相反全身敲除OXTR后TNBS诱导的结肠炎更加严重。但是OXT在其中的作用机制尚不明确。树突状细胞（dendritic cells,DCs）是最重要的抗原提呈细胞。其在固有免疫和获得性免疫应答的调节中都起到重要作用,能够介导炎症反应或者参与免疫耐受。在稳态下,不成熟或者半成熟的DCs较低表达MHC类分子和共刺激分子,主要功能是摄取和加工抗原,并将自身抗原呈递给T细胞,使T细胞缺失或者诱导产生调节T细胞（Treg）,从而介导免疫耐受。而在获取或者受到如LPS或者TNFα刺激时,未成熟的DCs开始分化成熟。成熟的DCs高表达MHC类分子和共刺激分子。此时的DCs与IL6、IL23和TNFα等炎症因子共同作用促使CD4+T细胞分化成Th1或Th17细胞引起结肠免疫应答,导致肠道组织受损,最终发展成IBD。我们发现树突状细胞（dendritic cells,DCs）也表达OXTR。基于OXT的抗炎功能以及DCs在IBD中发挥免疫调节作用,我们首次揭示OXT通过影响DCs功能,调节肠道黏膜免疫应答,发挥缓解IBD的作用。本研究将为临床治疗IBD提供新的方法和理论依据。第一部分缩宫素在树突状细胞中的调节作用及其机制实验目的:已有报道OXT具有免疫调节作用,但是具体的机制仍然不明确。DCs是最重要的抗原提呈细胞,其在调节固有免疫和获得性免疫应答中都起到了重要的作用,参与介导炎症反应或者免疫耐受。本研究的目的是探究OXT/OXTR信号系统是否影响DCs的功能,并探究其机制。实验方法:1.用GM-CSF和IL4体外诱导小鼠骨髓来源的DCs（Bonemarrow-derived DCs,BMDCs）。2.用percoll密度梯度离心法分离肠道固有层单个核细胞（lamina propria monomuclear cells,LPMCs）,用CD11c 阳选磁珠进行分选获得固有层树突状细胞（lamina propria dendritic cells,LPDCs）。3.通过免疫荧光和蛋白免疫印迹实验检测OXTR在DCs上的表达情况。4.利用CD11c-cre小鼠和OXTR-flox/flox（OXTRfl/fl）小鼠进行杂交,获得特异敲除CD11c+细胞上OXTR的小鼠（OXTRΔDC小鼠）。5.BMDCs刺激方法:在第七天收集诱导的BMDCs,分别加入OXT、LPS或者OXT预先孵育40分钟后再加入LPS刺激。如果需要使用抑制剂,先用抑制剂孵育BMDCs 20分钟。BMDCs在37℃ 5%CO2培养箱中培养。6.通过流式细胞术检测BMDCs膜表面MHC分子和CD80、CD86表达。7.利用qPCR和ELISA检测BMDCs产生的细胞因子。8.利用FITC-dextran检测BMDCs吞噬能力。9.利用FITC标记的乳酸杆菌和沙门氏菌检测BMDCs粘附细菌的能力。10.不同处理的BMDCs与初始CD4+T细胞共培养,利用流式细胞术检测CD4+T细胞分化。11.通过蛋白免疫印迹检测DCs中AKT和IκB磷酸化水平。实验结果:1.成功诱导BMDCs通过流式细胞术检测细胞表面CD11c表达大于90%,显微镜下观察到典型的DCs形态。2.DCs 表达 OXTR通过免疫荧光和免疫印迹检测小鼠BMDCs和肠LPDCs上OXTR表达情况。通过免疫荧光检测OXTR在人肠道DCs表达情况,采用CD11c标记DCs。结果显示小鼠BMDCs和LPDCs均表达OXTR,同样人的LPDCs也表达OXTR。3.OXTR△DC小鼠构建成功使用OXTRfl/fl小鼠与CD11c-Cre小鼠进行交配。通过PCR和琼脂糖凝胶电泳对子鼠进行基因鉴定。OXTR-flox阳性条带为375 bp,CD11c-Cre 阳性条带为313 bp。OXTRfl/fl/CD11c-Cre基因型小鼠即为OXTRΔDC小鼠。用qPCR检测OXTRfl/fl小鼠和OXTRΔDC小鼠的BMDCs的OXTR表达,OXTRΔDC小鼠的BMDCs的OXTR表达明显减少。用免疫印迹检测OXTRfl/fl小鼠和OXTR△DC小鼠的LPDCs的OXTR表达,OXTR△DC小鼠的LPDCs的OXTR表达明显减少。4.OXT抑制DCs成熟4.1 OXT抑制DCs表面表达MHCⅡ及共刺激分子用 LPS（100ng/ml,24 小时）刺激 BMDCs,BMDCs 表面 MHCⅡ、CD80 和CD86的表达增加。而预先孵育OXT（10-8M,40分钟）,LPS的作用被抑制了。4.2 OXT增强BMDCs的吞噬能力孵育OXT（24小时）增强未成熟BMDCs对FITC-Dextran的吞噬能力。预孵育OXT（10-8M,40分钟）增强成熟的BMDCs的吞噬能力。4.3 OXT通过OXTR抑制BMDCs产生炎症因子我们用qPCR检测细胞因子在转录水平的表达情况。LPS（100 ng/ml,24小时）刺激BMDCs,无论OXTRfl/fl小鼠的BMDCs还是OXTRΔDC小鼠的BMDCs中,Tnfα、Il12a以及Il23a表达均明显升高。提前孵育OXT的OXTRfl/fl小鼠BMDCs,明显减低Tnfα、I112a以及I123a的表达。而提前孵育OXT的OXTRΔDC小鼠BMDCs并不显着影响这些细胞因子的表达。我们用ELISA法检测BMDCs分泌到培养基中的炎症因子。LPS促进OXTR fl/fl的BMDCs分泌IL12p70和IL6,提前孵育OXT抑制了这些细胞因子的分泌。而对于 OXTRΔDC 的 BMDCs,用 LPS 刺激 BMDCs 24 小时,IL12p70 和 IL6 分泌增加。但是提前孵育OXT不能抑制LPS对BMDCs的作用。5.OXT通过其受体抑制BMDCs刺激T细胞应答的能力OXTRfl/fl BMDCs和OXTRΔDC BMDCs分别经LPS刺激或者先经OXT孵育40分钟再经LPS刺激24小时。分离DSS诱导的结肠炎小鼠的肠系膜淋巴结（mesenteric lymph nodes,MLN）,通过磁珠分选获得初始CD4+T细胞。分离的初始CD4+T细胞与BMDCs按1000:1的比例混匀培养3天,通过流式细胞术检测CD4+T细胞的分化情况。与LPS刺激的OXTRfl/fl BMDCs共培养的T细胞相比,提前孵育OXT的BMDCs抑制初始CD4+T细胞分化为Th1和Th17,但是不会影响Treg的分化。对于OXTRΔDC BMDCs,提前孵育OXT不影响初始CD4+T分化。6.OXT影响BMDCs对细菌的粘附作用OXT孵育的BMDCs促进其对的益生菌乳酸杆菌粘附,但是抑制对致病菌沙门氏菌的粘附。7.OXT激活BMDCs中PI3K/AKT信号通路抑制BMDCs的成熟7.1 OXT 激活 PI3K/AKT 通路孵育OXT（10-8M）促进BMDCs的AKT的磷酸化,该磷酸化被PI3K抑制剂 AS605240、Wortmannin 和 Ly294002,AKT 抑制剂 MK2206 以及 mTOR 抑制剂Rapamycin所抑制。7.2 OXT抑制LPS激活的NFκB通路LPS促进BMDCs中NFκB的抑制物IκB的磷酸化和降解;提取孵育OXT（10-8M,40分钟）抑制了 IκB的磷酸化。孵育PI3K抑制剂Wortmannin、AKT抑制剂MK2206 20分钟,OXT不再抑制IκB的磷酸化。7.3 OXT通过激活PI3K/AKT抑制BMDCs表达MHCII和共刺激分子加入 PI3K 抑制剂 AS605240、Wortmannin,AKT 抑制剂 MK2206 以及 mTOR抑制剂Rapamycin后,LPS刺激BMDCs表达MHCⅡ和CD86不再被OXT抑制。小结:1.DCs 表达 OXTR。2.OXT通过激活AKT通路下调NFκB活性,抑制DCs的成熟。3.OXT通过抑制DCs成熟,抑制其抗原提呈能力,抑制CD4+T细胞分化为Th1和Th 17,起到抗炎作用。第二部分树突状细胞通过缩宫素信号系统在实验性结肠炎中的作用实验目的:第一部分结果已经证实OXT抑制DCs的成熟及抗原提呈。DCs中OXT信号系统是否在IBD中发挥作用尚无报道。因此,我们通过构建DSS诱导的小鼠急性和慢性结肠炎模型,来探究DCs中OXT信号系统在IBD的发展中的作用及机制。实验方法:1.使用ELISA检测IBD病人与正常人（HC,Health Control）血浆中OXT的含量2.使用qPCR检测DSS小鼠与正常小鼠LPDCs上Oxtr的mRNA表达3.使用qPCR检测DSS小鼠与正常小鼠LPDCs中Tnfα和Il12a的mRNA表达4.建立DSS诱导的小鼠实验性结肠炎模型使用8-10周C57BL/6背景的野生小鼠、OXTRΔDC小鼠及其同窝OXTRfl/fl小鼠。在DSS诱导的急性结肠炎模型中,OXTRΔDC小鼠及其同窝OXTRfl/fl小鼠自由饮用2%DSS水溶液,7天。OXTRfl/fl-water组和OXTRΔDC-water组自由饮用正常水。在回输BMDCs实验中,小鼠自由饮用2.5%DSS水溶液,7天。在造模的第4天和第6天小鼠尾静脉注射BMDCs（106个细胞/只/天）或生理盐水（Control）。其中DC（Control）组注射只用LPS（100ng/ml,24小时）刺激的BMDCs,DC（OXT）组注射先用OXT（10-8M）孵育40分钟,再用LPS刺激BMDCs。在慢性DSS诱导的结肠炎模型中,采用间断式饮用DSS的方法,进行三个周期:分别给予3%、1.5%和2%的DSS水溶液各5天,在每次DSS之后给予7天的正常饮用水。造模期间每天记录小鼠体重,计算小鼠体重变化率。造模结束后,检测小鼠粪便情况、测量小鼠结肠长度。结肠组织前段提取RNA,后段固定在4%多聚甲醛中过夜之后石蜡包埋,切片进行H&E染色,进行疾病活动指数（Disease activity index,DAI）评分和组织学评分。5.流式细胞术分析小鼠肠道固有层DCs及T细胞变化情况5.1流式细胞术分析小鼠肠道DCs变化用percoll密度梯度离心分离DSS诱导的结肠炎小鼠的结肠LPMCs。LPMCS通过标记MHCII-FITC,CD64-PE,CD103-Percp/Cy5.5,CD11c-APC,CD45-APC/Fire750,CD11b-PacificBlue 分出 CD103+CD11b+、CD103+CD11b-和 CD103-CD11b+三种LPDCs亚群。5.2 流式细胞术分析小鼠肠道T细胞变化用percoll密度梯度离心分离LPMCs,通过标记CD4-FITC、Foxp3-PE、IFNγ-Percp/Cy5.5和IL17A-APC分出CD4+Foxp3+的Treg细胞、CD4+IFNγ+的Th1细胞以及CD4+IL17A+的Th17细胞。6.qPCR检测小鼠肠道细胞因子以及相关转录因子表达6.1 提取结肠组织中的RNA,逆转录成为cDNA,用qPCR检测I16,I123a和Tgfβ表达6.2 提取结肠组织中的RNA,逆转录成为cDNA,用qPCR检测Th1相关转录因子T-bet,Th2相关转录因子Gata3,Th17相关转录因子Rorγt以及Treg相关转录因子Foxp3表达实验结果:1.与正常人相比,IBD病人血浆中OXT含量增加。2.与正常小鼠相比,DSS的结肠炎模型小鼠LPDCs上Oxtr的mRNA表达降低3.与正常小鼠相比,DSS的结肠炎模型小鼠LPDCs上Tnfα和I112a的mRNA表达升高4.OXTR△DC小鼠对DSS诱导的急性结肠炎更加敏感造模第7天,OXTRfl/fl-water组和OXTRΔDC-water组体重无明显变化,结肠无明显差异。与OXTRfl/fl-DSS肠炎组小鼠相比,OXTRΔDC-DSS肠炎组小鼠体重明显降低,结肠缩短,DAI评分增加,组织学评分升高。与OXTRfl/fl-DSS肠炎组小鼠相比,OXTRΔDC-DSS肠炎组小鼠结肠炎症因子Il6和Il23的mRNA表达增加,而抑炎因子Tgfβ表达减少。5.OXTRΔDC小鼠DSS诱导的急性结肠炎固有层DCs和T细胞分群发生改变5.1 OXTRΔDC小鼠DSS诱导的急性结肠炎的LPDCs分群发生改变通过流式圈门CD45+CD11c+MHCII+CD64-得到LPDCs。在根据是否表达CD11b和CD103将LPDCs进行分群,与OXTRfl/fl肠炎组小鼠相比,OXTRΔDC肠炎组小鼠CD103+CD11b+LPDCs亚群比例更高,而CD103+CD11b-LPDCs和CD 103-CD11b+LPDCs亚群无明显变化。5.2 OXTRΔDC小鼠DSS诱导的急性结肠炎结肠中的Th1和Th17亚群比例增加流式细胞术的结果表明,与OXTRfl/fl肠炎组小鼠相比,OXTRΔDC肠炎组小鼠结肠中 CD4+IFNγ+Th1、CD4+IL17A+Th17 细胞比例更高,而 CD4+Foxp3+Treg的比例无明显变化。qPCR的结果表明,与OXTRfl/fl肠炎组小鼠相比,OXTRΔDC肠炎组小鼠肠道中Th1相关转录因子T-bet、Th17相关转录因子Rorγt的mRNA表达升高,而Th2相关转录因子Gata3、Treg相关转录因子Foxp3的mRNA表达没有明显变化。6.OXTR△DC小鼠对DSS诱导的慢性结肠炎更敏感慢性结肠炎模型中,OXTRfl/fl小鼠体重随着是否饮用DSS呈波动性变化,并在造模结束时体重恢复到实验初期。与之对比,OXTRΔDC小鼠体重尽管也呈现波动性变化,但是在饮用正常水期间体重恢复迟缓,在造模结束时体重仍然低于造模初期。与OXTRfl/fl小鼠相比,OXTRΔDC小鼠结肠更短,DAI评分和组织学评分更高。炎症因子116和1123的mRNA表达增加,而抑炎因子Tgfβ表达减少。7.在慢性结肠炎小鼠中,OXTR△DC小鼠肠道固有层中T细胞倾向于向Th17方向分化与OXTRfl/fl小鼠相比,OXTRΔDC小鼠肠道Th1 7相关转录因子Rorγt的mRNA表达更高,而其他相关转录因子表达量无明显变化。8.回输OXT孵育过的BMDCs缓解DSS诱导的小鼠急性结肠炎BMDCs在有OXT（DC（OXT））或无OXT（DC（Control））孵育后经LPS刺激成熟。在回输BMDCs实验中,DC（OXT）组小鼠体重降低程度明显小于DC（Control）组小鼠和Control组小鼠。同样,DC（OXT）组小鼠结肠长度比DC（Control）组小鼠和Control小鼠长,DAI评分低,组织学评分低。小结:1.IBD患者血浆中OXT异常升高。2.肠炎时,DCs的OXT信号影响LPDCs亚群比例及CD4+T细胞分化。当条件敲除DCs上OXTR（OXTRΔDC）时,DSS诱导的结肠炎加重,肠黏膜CD103+CD11b+DCs亚群比例更高,CD4+T倾向于Th1及Th17分化。3.静脉回输OXT孵育过的BMDCs能够缓解DSS诱导的结肠炎。这可能为临床治疗IBD提供新的方法参考。实验结论与创新性:1.OXT的抗炎作用已经被广泛认知,但是绝大多数的研究集中在巨噬细胞或者神经细胞上,我们的研究首次证明DCs表达OXTR,并且OXT通过激活DCs上的OXTR也起到了抗炎的作用。2.在体外,OXT通过激活AKT通路下调NFκB活性,抑制DCs的成熟,抑制Th1和Th17分化,从而限制LPS诱导的炎症反应。3.在体内,OXT信号系统影响CD103+CD11b+LPDCs亚群比例,抑制Th1和Th17分化,限制IBD的进一步发展。4.静脉注射OXT孵育的BMDCs缓解DSS诱导的实验性结肠炎,可能为临床治疗IBD提供新的方法。5.该研究进一步证明神经肽OXT参与免疫调节作用,为神经-免疫交流提供新的证据。
刘梦[8]（2021）在《自拟“平肠汤”对溃疡性结肠炎（UC）模型大鼠的疗效及作用机制初探》文中研究表明目的:通过观察自拟“平肠汤”对溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）模型大鼠肠黏膜屏障功能、紧密连接蛋白、炎症因子的影响,评价该方对UC大鼠的疗效,并从肠黏膜机械屏障、炎症反应的角度对平肠汤治疗UC的作用机制进行初步探讨。方法:选用62只雌雄各半的清洁级SD大鼠作为实验对象,随机分为空白对照组（n=10）及实验组（n=52）。实验组大鼠予以2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）/乙醇构建UC模型。建立模型24h后,随机处死2只实验组大鼠,通过观察肠黏膜损伤情况及病理学表现,评价UC大鼠模型建立情况。UC模型诱导成功后,将实验组50只大鼠再次随机分为阳性药组（5-ASA）、模型组（Model）、平肠汤高剂量组（PCT-H）、平肠汤中剂量组（PCT-M）、平肠汤低剂量组（PCT-L）,每组各10只。除空白对照组（Control）正常饲养外,各组均予以灌胃治疗14d。模型组给予0.9%氯化钠溶液,平肠汤各剂量组按照不同浓度给予平肠汤,阳性药组给予美沙拉秦混悬液。观察大鼠的一般情况（包括饮水、摄食量、大便情况、精神状态、活动情况、体质量变化）。干预2周后取材,并对疾病活动指数（disease activity index,DAI）进行评价。采用酶联免疫吸附（ELISA）法分别检测大鼠血清中白介素-6（interleukin-6,IL-6）、二胺氧化酶（diamine oxidase,DAO）、肿瘤坏死因子-α（tumour necrosis factor-α,TNF-α）的浓度。取结肠组织行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色,镜下观察肠黏膜病理表现,并采用Western blot法检测肠组织中occludin表达水平。结果:1、一般情况:与空白对照组相比,造模初期大鼠整体状态不佳,表现为精神萎靡,蜷缩成团,嗜睡少动,毛色黯淡无光,摄食饮水量下降,大便呈黏液便或水样便,肉眼可见少量血便,粪便次数增多,臭味明显,垫料污秽潮湿,肛周粪染明显。造模初期的大鼠体质量均有下降,后期大鼠体质量有所增长,但幅度均小于空白对照组,具有统计学差异（P<0.05）。经干预处理后,除模型组大鼠一般情况无明显缓解外,阳性药组及平肠汤各剂量组大鼠的一般情况均较干预前有不同程度的改善。其中以平肠汤高剂量组大鼠的整体改善情况最佳,平肠汤低剂量组改善程度最低。平肠汤中剂量与高剂量相比,两组大鼠体质量差异不具有统计学意义（P>0.05）。除模型组1只大鼠在干预第3d因操作不当发生死亡外,其余各组大鼠在实验中均无死亡。2、DAI评分:干预14d后,与空白对照组相比,各组大鼠DAI评分差异均有统计学意义（P<0.05）。与模型组相比,阳性药组、平肠汤中剂量组、高剂量组、低剂量组DAI评分差异有统计学意义（P<0.05）。与阳性药组相比,平肠汤低剂量组DAI评分更高,平肠汤高剂量组DAI评分更低,均有统计学差异（P<0.05）。平肠汤中剂量组与阳性药组的DAI评分无统计学差异（P>0.05）。3、大鼠血清DAO、TNF-α、IL-6检测:治疗结束后,各组与空白对照组相比,血清DAO、TNF-α、IL-6浓度上升,均有统计学差异（P<0.05）。阳性药组、平肠汤各剂量组与模型组相比,DAO、TNF-α、IL-6浓度降低,具有统计学差异（P<0.05）。其中,阳性药组DAO、TNF-α、IL-6浓度高于平肠汤中高剂量组,低于平肠汤低剂量组,而平肠汤高剂量组DAO、TNF-α、IL-6浓度下降程度最明显,差异均有统计学意义（P<0.05）。4、Occludin蛋白表达:各组大鼠结肠组织中occludin表达水平较空白对照组下调,均有统计学差异（P<0.05）。经干预处理后,与模型组相比,阳性药组及平肠汤各剂量组occludin表达明显上调,均有统计学差异（P<0.05）。其中,以平肠汤高剂量组上调幅度最显着,平肠汤低剂量组上调幅度最小,均具有统计学差异（P<0.05）。5、结肠组织病理学:与空白对照组相比,模型组肠黏膜上皮不连续,隐窝结构破坏,缺损明显,局部可见深达肌层组织的溃疡,腺体损伤严重,排列紊乱,可见炎性细胞浸润。阳性药组肠黏膜上皮欠完整,隐窝中度缺损,排列欠规则,可见少量炎性细胞浸润。平肠汤高剂量组肠黏膜上皮较连续,隐窝结构基本完整,未见明显炎性细胞浸润。平肠汤中剂量组肠黏膜上皮欠完整,隐窝结构轻度受损,排列欠规则,黏膜下见少许炎性细胞浸润。平肠汤低剂量组肠黏膜上皮不完整,黏膜下层组织破坏,隐窝结构呈中度缺损,排列不规则,伴炎性细胞浸润。结论:1.平肠汤能够改善UC大鼠一般情况、DAI评分、结肠组织病理学炎症表现,降低大鼠血清TNF-α、IL-6、DAO浓度水平,上调大鼠结肠组织中occludin蛋白表达,有效治疗UC大鼠,其中以平肠汤高剂量组疗效最佳。2.本研究证实平肠汤可以通过修复TJ,改善肠黏膜通透性,增强肠黏膜机械屏障功能,同时下调促炎细胞因子的表达,抑制炎症反应,促进黏膜愈合,从而发挥治疗UC模型大鼠的作用。3.本实验结果显示自拟“平肠汤”对UC大鼠疗效确切,通过动物实验再次证实了“大肠湿热、脾胃虚弱、肝郁脾虚、肠道脉络损伤”是UC的病因病机,“清热利湿解毒、益气养血柔肝、凉血收敛止血、缓急止痛”是其治法,符合临床实际,可供临床选择。
殷韶杰[9]（2021）在《青蒿琥酯通过ERS-UPR信号通路调控溃疡性结肠炎的作用机制研究》文中研究表明溃疡性结肠炎（ulcerativecolitis,UC）是一种影响直肠和结肠的非特异性、复发性结肠黏膜炎症性疾病。UC的发病原因尚没有完全阐明,目前认为是基因、肠道菌群、宿主免疫系统和环境等多因素相互作用的结果。在UC中,肠道屏障被破坏,导致肠道菌群移位和免疫系统过度激活,进而引起炎症反应。内质网借助庞大的内膜系统与其他细胞器联系在一起。因此,内质网能够感知各种不断变化的生理信号,从而调整其多种功能,以维持细胞内稳态。内质网正确折叠蛋白质的环境平衡被破坏可引发内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）,从而激活未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR）。越来越多的研究表明ERS-UPR信号通路参与了 UC的发生与发展。持续未缓解的ERS可诱导上皮细胞凋亡、损害肠道屏障、激活肠道炎症和引发免疫失调导致UC。因此,调控ERS被认为是UC的一种潜在治疗方法。研究表明多种青蒿素类药物（artemisinins,ARTs）对实验性结肠炎具有保护作用,但该保护作用是否依赖于ERS-UPR信号通路还不够明确。青蒿琥酯（artesunate,ARS）作为一种水溶性青蒿素衍生物,在临床上得到广泛使用。为此本研究选用ARS作为研究对象,以ERS及其感应的三条UPR信号通路为切入点,在小鼠UC模型和体外细胞模型中开展ARS对ERS-UPR通路调控作用的研究。通过检测ERS-UPR信号通路、炎症信号通路和肠道免疫反应中关键基因和蛋白表达以及免疫细胞的变化,阐明ARS对肠道炎症性疾病发挥保护作用的潜在机制,为ARTs在动物肠道炎性疾病中的应用提供参考依据。1 ARS对DSS诱导小鼠UC的预防保护作用本研究利用DSS饮水7d诱导小鼠结肠炎,并每天一次给予30mg/kgARS腹腔注射处理。通过观察小鼠体重变化,结肠长度、疾病活动指数（Disease activity index,DAI）,同时利用HE染色和电镜扫描观察结肠组织病理学变化来综合评估ARS对结肠炎的保护作用。结果表明,DSS刺激导致小鼠体重减轻、DAI升高和结肠缩短,以及肠黏膜上皮细胞侵蚀、杯状细胞减少、隐窝破坏并伴有炎症细胞浸润等典型病变;而ARS处理可明显缓解上述症状和病理变化。免疫荧光和Western blot分析发现,ARS明显抑制了 DSS诱导的结肠黏膜层黏蛋白2（Muc2）和紧密连接蛋白Claudin-1的丢失,并上调了 Bcl-2/Bax的比值,而下调了 cleaved-caspase-3的表达。这提示ARS对UC小鼠肠屏障具有明显的保护作用。然后,利用Western blot和RT-qPCR技术分别检测了核因子-κB（NF-κB）的磷酸化水平和炎症细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的表达情况。结果表明,ARS显着抑制了 UC小鼠结肠组织中核因子-κBα（IκBα）、NF-κB p65的活化和IL-1β、IL-6、TNF-α的表达,说明ARS能明显抑制DSS诱导的结肠组织炎症反应。以上数据表明,ARS可通过维持肠黏膜屏障重要蛋白的表达、抑制结肠上皮细胞凋亡和炎症反应,减轻结肠病变及临床症状,从而对UC小鼠发挥预防保护作用。2 ARS对结肠组织ERS信号通路的抑制作用研究我们对小鼠结肠组织中ERS标志性蛋白的表达进行了检测。Western blot和免疫荧光结果显示,DSS暴露导致ERS标志蛋白GRP78和CHOP表达显着增加,并激活了UPR感应蛋白PERK、IRE1、ATF6及其信号通路。然而,ARS通过阻止UPR中的PERK-eIF2α-ATF4-CHOP和IRE1α-XBP1信号通路的激活,显着抑制了 ERS的严重程度。为了探讨ERS是否参与了 ARS对结肠屏障的维护和NF-κB活化的抑制。我们借助ERS抑制剂4-PBA和诱导剂2-DG,分别与ARS共处理DSS诱导的UC模型小鼠。结果显示,在ARS作用基础上,4-PBA共处理对caspase12表达和Bcl-2/Bax比值无明显影响,但可进一步抑制PERK-eIF2α-ATF4-CHOP和IRE1α-XBP1信号通路的激活;2-DG则显着地逆转了 ARS对上述信号通路的抑制作用。这表明4-PBA和2-DG可用于调控ERS的严重程度。与ARS单独治疗组相比,4-PBA共处理可加强ARS对屏障蛋白cluadin-1和Muc2的保护作用,以及对NF-κB和IL-1β、IL-6、TNF-α表达的抑制作用;同时,4-PBA加强了 ARS对UC小鼠的临床症状和病理变化的缓解作用;2-DG则显着逆转了 ARS对上述指标的调控作用。上述结果提示,过度的ERS是DSS导致UC发生发展的重要原因,ARS可通过抑制ERS及其下游PERK-eIF2α-ATF4-CHOP和IRE1α-XBP1信号通路的过度激活,进而抑制结肠炎症的发展并维护肠道屏障功能。3 ARS对肠上皮细胞ERS的抑制作用研究本研究利用ARS预处理IEC-6细胞,并利用ERS诱导剂衣霉素（tunicamycin,Tm）刺激细胞诱导ERS,以探讨ARS在IEC-6细胞中对ERS的抑制作用以及ERS对Claudin-1和NF-κB的调控作用。首先我们利用CCK8确定了 ARS和Tm的工作浓度分别为1 μM和2μM;Tm刺激时间为12h。随后,用浓度为2μM的Tm刺激细胞不同时间,观察ERS标志蛋白GRP78和CHOP,以及紧密连接蛋白Claudin-1的表达和NF-κB活化情况。Western blot结果显示,随着时间的延长,GRP78和CHOP表达量以及p-p65/p65和p-IκB/IκB比值逐渐升高,且12h时效果最显着。此外Tm刺激12h可显着降低Claudin-1的表达量。这表明在IEC-6细胞中,ERS可以激活NF-κB并抑制Claudin-1的表达。ARS处理可显着抑制Tm对细胞内IRE1α-XBP1s和PERK-eIF2α-ATF4-CHOP两条信号通路的激活,并缓解ERS对NF-κB和Claudin-1的调控作用。进一步研究发现,siRNAPERK和siRNAIRE1α转染细胞可分别显着抑制PERK-eIF2α-ATF4-CHOP 和 IRE1α-XBP1s 信号通路的活化,其中 PERK-eIF2α-ATF4-CHOP 通路在培养细胞中主要调控Claudin-1的表达,而IRE1α-XBP1s信号通路主要负责调控NF-κB的激活。4 ARS在结肠炎治疗中的免疫调控作用已有研究表明先造模后治疗的结肠炎模型更适合探讨药物对肠道先天和获得性免疫的调控作用。因此,我们用DSS刺激小鼠7d诱导UC,再用剂量为30mg/kg的ARS治疗5 d,每天一次以观察ARS对小鼠免疫细胞的调控作用以及UC的治疗作用。为了探讨ARS在UC中对Th17、Treg和巨噬细胞的调控作用,我们采用流式细胞术检测小鼠脾脏中Th17和Treg细胞在CD4+细胞中的比率以及结肠组织中巨噬细胞M2/M1型的比例,并通过RT-qPCR技术对这四种细胞的标志基因和分泌的细胞因子在结肠组织中的表达进行了检测。与DSS组小鼠相比,ARS治疗可显着抑制Th17细胞在CD4+细胞中的比率,以及IL-17A、IL-17F和RORγt mRNA的表达,但促进TGF-β mRNA的表达。此外,ARS治疗明显地升高了结肠组织中巨噬细胞M2/M1的比值和Arg-1和IL-10 mRNA的表达,并抑制了炎症因子iNOS、IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA的表达。同时ARS治疗显着缓解了 UC小鼠的临床症状和结肠组织病理变化。这说明,ARS可通过调控Th17/Treg细胞的平衡和促进巨噬细胞的M2极化而对DSS诱导的UC发挥治疗作用。5 ARS通过抑制ERS调控肠道免疫为了探讨ERS是否参与了 ARS对结肠肠道免疫的调控以及对UC的治疗作用,我们利用4-PBA和2-DG,分别与ARS共处理DSS诱导的UC小鼠。结果显示,在ARS治疗的基础上,4-PBA共处理可进一步抑制脾脏CD4+细胞中Th17细胞的比率,以及IL-17A、IL-17F和RORγt mRNA在结肠中的表达,但对Treg细胞和TGF-β无明显影响。相比于ARS单独治疗组,4-PBA共处理可显着升高结肠组织中巨噬细胞M2/M1型的比值;并加强ARS对Arg-1和IL-10 mRNA表达的促进作用,以及对iNOS、IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表达的抑制作用。此外,4-PBA促进了 ARS对UC小鼠的临床症状和病理变化的缓解作用。相反,2-DG则显着抵消了 ARS对上述指标的调控作用。以上结果表明,ERS参与了 ARS对Th17/Treg细胞平衡和巨噬细胞极化的调控。
周翀[10]（2021）在《CXCLs/ERK/LIF信号通路在癌相关脂肪细胞介导乳腺癌细胞迁移和侵袭中的作用与分子机制》文中研究说明肿瘤侵袭和转移是导致乳腺癌病人死亡的主要原因。肿瘤的发生与其所处的微环境密切相关,乳腺肿瘤微环境中脂肪细胞含量丰富,乳腺癌早期局部肿瘤细胞侵入脂肪组织,诱导脂肪细胞转变为癌相关脂肪细胞（cancer-associated adipocytes,CAA）。CAA表型发生改变,并分泌大量的细胞因子和趋化因子,促进邻近乳腺癌的侵袭和转移,然而其在乳腺肿瘤微环境中的作用及相关分子机制尚不明确。目的:研究乳腺肿瘤微环境的CAA如何影响乳腺癌细胞进展以及脂肪细胞与乳腺癌细胞的相互作用关系,重点研究白血病抑制因子（LIF）在其中的作用与分子机制。方法:1、分离前脂肪细胞进行原代细胞培养,并诱导前脂肪细胞生成成熟脂肪细胞;利用transwell共培养小室建立成熟脂肪细胞和乳腺癌细胞互作的体外研究模型;细胞划痕、transwell迁移和基质胶侵袭实验被用来评估与脂肪细胞共培养后乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力;Q-PCR和ELISA分析共培养后脂肪细胞LIF的表达及培养上清中LIF的含量;Western blot分析乳腺癌细胞中LIF下游信号的激活情况;si RNA干扰乳腺癌细胞中Stat3表达并检测CAA和LIF对其迁移和侵袭等影响;利用H&E染色和免疫组化分析乳腺癌患者组织切片中LIF和p-Stat3的表达情况。2、采用选择性通路抑制剂探究CAA中LIF的上游通路,Q-PCR检测CAA中调控LIF表达的上游信号通路;Western blot分析CAA中LIF上游信号通路的调控关系;免疫荧光分析CAA中LIF上游信号的表达与定位。3、采用RNA-seq分析共培养后乳腺癌细胞中的差异表达基因并筛选调控LIF的关键分泌蛋白并经Q-PCR验证;利用Q-PCR、ELISA和Western blot分析ELR+CXC趋化因子的受体抑制剂对CAA中LIF的表达、分泌及其上游信号通路的调控情况;利用Q-PCR、ELISA和Western blot分析重组蛋白CXCL3和CXCL8对LIF的表达、分泌及其上游信号通路的调控情况;通过免疫荧光分析重组蛋白CXCL3和CXCL8对LIF的上游转录因子定位的影响;以及利用Q-PCR和Western blot分析CXCL3中和性抗体对乳腺癌源性CXCLs诱导的LIF的表达、分泌及其上游信号通路激活的影响;通过Q-PCR分别检测正常乳腺组织和乳腺癌、正常脂肪组织和癌旁脂肪组织中CXCL1-3和CXCL8的表达情况。结果:1、原代培养人前脂肪细胞,并诱导为成熟脂肪细胞。通过transwell小室将脂肪细胞与乳腺癌细胞共培养36 h,Q-PCR检测发现,脂肪细胞中脂肪细胞的分化标志物PPAR-γ、C/EBP-α表达明显降低,HSL及促炎因子IL-1β、IL-6、CCL2的表达明显升高;油红O染色显示,与单独培养的脂肪细胞相比,与乳腺癌细胞共培养后的脂肪细胞内脂滴变小,表明与乳腺癌细胞共培养后脂肪细胞转变为CAA。2、与乳腺癌细胞共培养后脂肪细胞中LIF m RNA水平显着上调,脂肪细胞上清中LIF的含量明显增多。H&E染色和免疫组化结果显示,与正常乳腺组织中的脂肪细胞相比,毗邻乳腺癌组织的脂肪细胞高表达LIF。3、重组蛋白rh LIF和CAA培养上清（CAA-CM）均能显着促进乳腺癌MDA-MB-231和BT549细胞的迁移和侵袭以及其胞内Stat3的磷酸化;LIF中和性抗体可以逆转CAA-CM对MDA-MB-231和BT549迁移侵袭及Stat3磷酸化的促进作用。4、Stat3特异性抑制剂Stattic可以分别逆转CAA-CM或rh LIF对MDA-MB-231和BT549细胞的迁移和侵袭及其胞内Stat3磷酸化的促进作用。利用si RNA敲低MDA-MB-231中Stat3的表达显着抑制CAA-CM诱导的MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭;对临床乳腺癌组织标本的免疫组化结果显示,乳腺癌癌旁脂肪细胞LIF的表达与乳腺癌细胞Stat3的磷酸化呈正相关。5、在共培养体系中分别加入LY3214996和PD98059（两者均为ERK1/2抑制剂）、JSH-23和BAY 11-7082（两者均为NF-κB抑制剂,且后者可以抑制p65的磷酸化）以及Stattic（Stat3抑制剂）后,脂肪细胞LIF m RNA表达受到显着抑制。此外,与MDA-MB-231细胞共培养后,脂肪细胞内ERK1/2、NF-κB p65和Stat3磷酸化水平均显着增强。向共培养体系加入LY3214996,脂肪细胞内ERK1/2的磷酸化被显着抑制,同时Stat3和p65磷酸化水平也被明显抑制;免疫荧光实验发现,与单独培养的脂肪细胞相比,与乳腺癌细胞共培养后脂肪细胞Stat3和p65蛋白的入核明显增多。6、通过RNA-seq筛选与脂肪细胞共培养后乳腺癌MDA-MB-231细胞中的差异表达的分泌蛋白基因,其中ELR+CXC趋化因子亚家族成员CXCLs（CXCL1、CXCL2、CXCL3和CXCL8）的差异表达较显着;Q-PCR验证差异表达的分泌蛋白基因与RNA-seq筛选的结果一致。7、通过Q-PCR、ELISA和Western Blot发现与MDA-MB-231共培养后,CAA中LIF m RNA表达,CAA上清中LIF的含量,以及脂肪细胞胞内ERK1/2、NF-κB和Stat3磷酸化水平,均受到CXCR2的抑制剂SB225002的抑制;重组蛋白CXCL3和CXCL8均能诱导脂肪细胞ERK1/2、NF-κB p65和Stat3磷酸化,并上调LIF的表达,这种作用受CXCR2的抑制剂SB225002的显着抑制;并且在共培养体系中,CXCL3中和性抗体与SB225002的作用一致。8、通过Q-PCR检测发现,与正常乳腺组织相比,ELR+CXC趋化因子亚家族成员CXCL1、CXCL2、CXCL3和CXCL8 m RNA水平在乳腺癌组织和癌旁脂肪组织中均显着上调。9、Q-PCR结果显示,LIF能上调乳腺癌细胞中CXCL1、CXCL2、CXCL3和CXCL8的表达。因此LIF和CXCLs在乳腺癌细胞和脂肪细胞相互作用过程中形成恶性正反馈环。结论:乳腺癌细胞源性和CAA源性的CXCLs通过与CAA细胞表面受体CXCR2结合,激活ERK1/2信号通路,随后激活转录因子Stat3和NF-κB p65,使其磷酸化入核并启动LIF表达;CAA分泌LIF增多,通过旁分泌作用于乳腺癌细胞,激活乳腺癌细胞Stat3信号从而促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭。
二、Influence of anti-TNFα Monocolonal Antibody on Intestinal Barrier in Rats with Acute Pancreatitis（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Influence of anti-TNFα Monocolonal Antibody on Intestinal Barrier in Rats with Acute Pancreatitis（论文提纲范文）
（3）松花粉多糖对鸡肠道黏膜免疫的影响及巨噬细胞的免疫调节作用（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 松花粉及多糖概述 |
| 2 多糖的生物活性 |
| 2.1 多糖的免疫调节活性 |
| 2.2 多糖的抗病毒活性 |
| 2.3 多糖的抗肿瘤活性 |
| 2.4 多糖的其他生物学活性 |
| 3 黏膜免疫 |
| 3.1 肠道黏膜免疫屏障 |
| 3.2 多糖对肠道黏膜免疫的影响 |
| 4 肠道菌群 |
| 4.1 肠道菌群高通量测序 |
| 4.2 多糖对肠道菌群的影响 |
| 5 巨噬细胞 |
| 5.1 多糖对巨噬细胞的免疫调节活性 |
| 5.2 巨噬细胞表面受体 |
| 5.3 多糖对巨噬细胞的免疫调节信号转导途径 |
| 6 研究目的与意义 |
| 第二章 松花粉多糖对黏膜免疫的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 多糖 |
| 1.1.2 实验动物及毒株 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.1.5 多糖溶液配制 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 实验动物分组及处理 |
| 1.2.2 体重及免疫器官称重 |
| 1.2.3 外周血淋巴细胞转化率测定 |
| 1.2.4 外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞含量检测 |
| 1.2.5 SIg A含量测定 |
| 1.2.6 血清中IgG含量的检测 |
| 1.2.7 qPCR检测肠道黏膜细胞因子 |
| 1.2.8 qPCR检测肠道黏膜免疫相关分子 |
| 1.2.9 PPPS对肠绒毛结构的影响 |
| 1.2.10 PPPS的攻毒保护作用 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 PPPS对体重及免疫器官的影响 |
| 2.2 PPPS对外周血淋巴细胞转化率的影响 |
| 2.3 PPPS对外周血CD4+、CD8+T 淋巴细胞含量变化的影响 |
| 2.4 PPPS对肠道黏膜SIgA和血清IgG的影响 |
| 2.5 PPPS对肠道黏膜细胞因子的影响 |
| 2.6 PPPS对肠道黏膜免疫相关分子mRNA的影响 |
| 2.7 PPPS对肠绒毛结构的影响 |
| 2.7.1 PPPS对十二指肠绒毛长度、宽度、隐窝深度及V/C值的影响 |
| 2.7.2 PPPS对空肠绒毛长度、宽度、隐窝深度及V/C值的影响 |
| 2.7.3 PPPS对回肠绒毛长度、宽度、隐窝深度及V/C值的影响 |
| 2.8 PPPS对肠绒毛形态的影响 |
| 2.8.1 口服PPPS7 天对肠绒毛形态的影响 |
| 2.8.2 口服PPPS14 天对肠绒毛形态的影响 |
| 2.8.3 口服PPPS21 天对肠绒毛形态的影响 |
| 2.9 PPPS对 NDV攻毒保护作用 |
| 2.9.1 攻毒后PPPS对体重及存活率的影响 |
| 2.9.2 攻毒后PPPS对肠道黏膜中病毒载量的影响 |
| 2.9.3 攻毒后肠道黏膜及肺脏组织学观察 |
| 2.10 PPPS对 H9N2 攻毒保护作用 |
| 2.10.1 攻毒后PPPS对肺脏病理变化影响 |
| 2.10.2 攻毒后PPPS对肺脏中病毒载量的影响 |
| 3 分析与讨论 |
| 第三章 松花粉多糖对鸡肠道菌群的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 多糖及溶液配制 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 样品采集 |
| 1.2.2 样本DNA提取 |
| 1.2.3 PCR扩增与产物纯化 |
| 1.2.4 生物信息学和统计分析 |
| 1.2.5 测序数据质量优化 |
| 1.2.6 OTU聚类及Venn图绘制 |
| 1.2.7 物种相对丰度图及热图 |
| 1.2.8 α多样性及UPGMA聚类树分析 |
| 1.2.9 qPCR验证测序结果 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 数据质量分析 |
| 2.2 基于OTU的 Venn图 |
| 2.3 物种相对丰度图 |
| 2.4 α多样性指数分析 |
| 2.5 等级聚类曲线 |
| 2.6 稀释曲线 |
| 2.7 UPGMA聚类树 |
| 2.8 qPCR验证 |
| 3 分析与讨论 |
| 第四章 松花粉多糖对巨噬细胞的免疫调节作用 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 多糖及溶液配制 |
| 1.1.2 细胞 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 巨噬细胞的复苏与培养 |
| 1.2.2 PPPS对 HD11 细胞增殖的影响 |
| 1.2.3 PPPS对 HD11 细胞吞噬作用的影响 |
| 1.2.4 PPPS对 HD11 细胞活性氧水平的影响 |
| 1.2.5 PPPS对 HD11 细胞分泌NO的影响 |
| 1.2.6 PPPS对 HD11 细胞分泌IL-1β和TNF-α的影响 |
| 1.2.7 细胞总RNA提取及质量检测 |
| 1.2.8 mRNA测序及数据分析 |
| 1.2.9 miRNA测序及数据分析 |
| 1.2.10 PPPS对 HD11 细胞受体的影响 |
| 1.2.11 MAPK抑制剂对HD11 细胞分泌NO、TNF-α和IL-1β的影响 |
| 1.2.12 PPPS对 HD11 细胞NF-κB分子的影响 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 PPPS对 HD11 细胞的免疫增强作用 |
| 2.1.1 PPPS对 HD11 细胞增殖作用 |
| 2.1.2 PPPS对 HD11 细胞吞噬作用的影响 |
| 2.1.3 PPPS对 HD11 细胞释放ROS的影响 |
| 2.1.4 PPPS对 HD11 细胞释放NO和 i NOS mRNA水平的影响 |
| 2.1.5 PPPS对 HD11 细胞分泌细胞因子的影响 |
| 2.2 PPPS对 HD11 细胞免疫调节作用转录组分析 |
| 2.2.1 测序数据与参考序列比对结果 |
| 2.2.2 皮尔逊相关系数和PCA分析结果 |
| 2.2.3 DEGs的鉴定和分析 |
| 2.2.4 DEGs的 GO和 KEGG通路富集分析 |
| 2.2.5 差异表达mRNA qPCR验证 |
| 2.2.6 miRNA测序分析及测序数据质量 |
| 2.2.7 miRNA差异表达鉴定和分析 |
| 2.2.8 miRNA靶基因的GO和 KEGG通路富集分析 |
| 2.2.9 差异表达miRNA的 qPCR验证 |
| 2.3 PPPS对 HD11 细胞受体的影响 |
| 2.3.1 PPPS对 HD11 细胞受体TLR2、4、MR的影响 |
| 2.3.2 TLR4 抑制剂抑制HD11 细胞分泌IL-1β、TNF-α、NO |
| 2.4 MAPK抑制剂抑制PPPS诱导HD11 细胞分泌IL-1β、TNF-α、NO |
| 2.5 PPPS对 HD11 细胞NF-κB分子的影响 |
| 2.5.1 PPPS上调HD11 细胞NF-κB分子mRNA水平 |
| 2.5.2 NF-κB抑制剂抑制HD11 细胞分泌IL-1β、TNF-α、NO |
| 3 分析与讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（4）氨暴露下肠道菌群在肉鸡呼吸道与肠道炎症的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 鸡舍氨气的来源 |
| 1.2 鸡舍氨气的限值及浓度现状 |
| 1.3 氨气对呼吸道的影响 |
| 1.3.1 氨气对呼吸道屏障的影响 |
| 1.3.2 氨气对呼吸道炎症的影响 |
| 1.3.3 氨气对呼吸道菌群的影响 |
| 1.4 氨气对肠道的影响 |
| 1.4.1 氨气对肠道屏障的影响 |
| 1.4.2 氨气对肠道炎症的影响 |
| 1.4.3 氨气对肠道菌群的影响 |
| 1.5 菌群在呼吸道疾病或感染过程中的作用 |
| 1.5.1 呼吸道菌群 |
| 1.5.2 肠道菌群 |
| 1.6 肠道与呼吸道之间的桥梁 |
| 1.6.1 肠道与呼吸道的炎症桥梁 |
| 1.6.2 肠道与呼吸道的菌群桥梁 |
| 1.7 本研究的目的和意义 |
| 1.7.1 研究目的及意义 |
| 1.7.2 技术路线 |
| 第二章 不同浓度氨暴露对肉鸡呼吸道和肠道炎症因子与菌群的影响 |
| 2.1 不同浓度氨暴露对肉鸡生长性能、呼吸道和肠道的组织学结构、炎症因子影响 |
| 2.1.1 材料与方法 |
| 2.1.1.1 试验动物及试验设计 |
| 2.1.1.2 样品采集 |
| 2.1.1.3 样品测定 |
| 2.1.2 数据处理 |
| 2.1.3 结果 |
| 2.1.3.1 组织学变化 |
| 2.1.3.2 生产性能 |
| 2.1.3.3 血清中的细胞因子 |
| 2.1.3.4 气管中的细胞因子 |
| 2.1.3.5 回肠中的细胞因子 |
| 2.1.3.6 气管细胞因子与回肠细胞因子的关系 |
| 2.1.4 讨论 |
| 2.1.5 小结 |
| 2.2 不同浓度氨暴露对肉鸡呼吸道和肠道菌群的影响 |
| 2.2.1 材料与方法 |
| 2.2.1.1 试验动物及试验设计 |
| 2.2.1.2 样品采集 |
| 2.2.1.3 样品测定 |
| 2.2.2 数据处理 |
| 2.2.3 结果 |
| 2.2.3.1 肉鸡气管和回肠微生物群的16S r RNA序列数据 |
| 2.2.3.2 肉鸡气管和回肠微生物群的多样性变化 |
| 2.2.3.3 肉鸡气管和回肠微生物分类学组成的变化 |
| 2.2.3.4 肉鸡气管和回肠微生物的趋势变化关联 |
| 2.2.4 讨论 |
| 2.2.5 小结 |
| 第三章 氨暴露下肠道菌群在肉鸡呼吸道和肠道炎症的潜在作用机制研究 |
| 3.1 氨暴露下肠道菌群在肠道炎症的潜在作用机制研究 |
| 3.1.1 材料与方法 |
| 3.1.1.1 试验动物及试验设计 |
| 3.1.1.2 样品采集 |
| 3.1.1.3 样品测定 |
| 3.1.1.4 数据分析 |
| 3.1.2 结果 |
| 3.1.2.1 氨暴露对肠道上皮屏障的影响 |
| 3.1.2.2 氨暴露对肠道炎症的影响 |
| 3.1.2.3 氨暴露对肠道菌群的影响 |
| 3.1.2.4 氨暴露下肠道菌群与肠道炎症的相关分析 |
| 3.1.3 讨论 |
| 3.1.4 小结 |
| 3.2 氨暴露下肠道菌群在呼吸道炎症的潜在作用机制研究 |
| 3.2.1 材料与方法 |
| 3.2.1.1 试验动物及试验设计 |
| 3.2.1.2 样品采集 |
| 3.2.1.3 样品测定 |
| 3.2.1.4 数据分析 |
| 3.2.2 结果 |
| 3.2.2.1 氨暴露对气管屏障的影响 |
| 3.2.2.2 氨暴露对气管炎症的影响 |
| 3.2.2.3 氨暴露对气管菌群的影响 |
| 3.2.2.4 氨暴露下肠道菌群与气管炎症损伤相关分析 |
| 3.2.2.5 氨暴露下肠道菌群与呼吸道菌群动态变化分析 |
| 3.2.3 讨论 |
| 3.2.4 小结 |
| 第四章 肠道菌群通过TLR4/TNF-α信号通路调节氨暴露下呼吸道和肠道炎症 |
| 4.1 肠道菌群通过TLR4/TNF-α信号通路调节氨暴露下的呼吸道炎症 |
| 4.1.1 材料与方法 |
| 4.1.1.1 试验动物及试验设计 |
| 4.1.1.2 样品采集 |
| 4.1.1.3 样品测定 |
| 4.1.1.4 数据分析 |
| 4.1.2 结果 |
| 4.1.2.1 气管组织学变化 |
| 4.1.2.2 呼吸道菌群变化 |
| 4.1.2.3 TLR4/TNF-α信号通路的验证 |
| 4.1.3 讨论 |
| 4.1.4 小结 |
| 4.2 肠道菌群通过TLR4/TNF-α信号通路调节氨暴露下的肠道炎症 |
| 4.2.1 材料与方法 |
| 4.2.1.1 试验动物及试验设计 |
| 4.2.1.2 样品采集 |
| 4.2.1.3 样品测定 |
| 4.2.1.4 数据分析 |
| 4.2.2 结果 |
| 4.2.2.1 组织学变化 |
| 4.2.2.2 TLR4/TNF-α信号通路的验证 |
| 4.2.3 讨论 |
| 4.2.4 小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 本论文的创新点 |
| 5.3 有待进一步研究的问题 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）蒙药“巴布-7”对大肠杆菌性腹泻小鼠肠黏膜屏障保护机制的相关研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 大肠杆菌及大肠杆菌性腹泻的相关概述 |
| 1.1.1 大肠杆菌的概述 |
| 1.1.2 大肠杆菌性腹泻病的概述 |
| 1.2 蒙医药及蒙药“巴布-7”研究进展 |
| 1.2.1 蒙医药研究进展 |
| 1.2.2 蒙药“巴布-7”研究进展 |
| 1.3 大黄素研究进展 |
| 1.4 肠道屏障的概述 |
| 1.4.1 肠道屏障功能的概述 |
| 1.4.2 肠黏膜机械屏障 |
| 1.4.3 肠黏膜免疫屏障 |
| 1.4.4 肠黏膜化学屏障 |
| 1.4.5 肠黏膜生物屏障 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 2 大肠杆菌性腹泻模型的建立 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 试剂与耗材 |
| 2.1.2 实验用菌 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 受试菌培养及菌悬液制备 |
| 2.2.2 腹泻模型建立方法 |
| 2.2.3 模型评价标准 |
| 2.3 数据处理 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 小鼠临床症状 |
| 2.4.2 DAI评分、腹泻率及死亡率 |
| 2.4.3 小鼠肠道病理学观察及炎性因子的检测 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 3 蒙药BBS复方对大肠杆菌性腹泻小鼠肠黏膜生物屏障的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验用菌 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 药物制备 |
| 3.2.2 受试菌培养 |
| 3.2.3 实验分组及给药方案 |
| 3.2.4 DNA提取 |
| 3.2.5 16S rRNA基因扩增 |
| 3.2.6 文库构建和测序 |
| 3.2.7 测序数据处理 |
| 3.2.8 OTU聚类和物种注释 |
| 3.2.9 样本复杂度分析(Alpha Diversity) |
| 3.2.10 多样本比较分析(Beta Diversity) |
| 3.3 数据统计 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 物种多样性曲线及物种累积箱形图结果 |
| 3.4.2 Alpha Diversity指数分析结果 |
| 3.4.3 多样本比较分析结果(Beta Diversity) |
| 3.4.4 门水平分析结果 |
| 3.4.5 目水平分析结果 |
| 3.4.6 属水平分析结果 |
| 3.4.7 LEf Se分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 4 蒙药BBS复方对大肠杆菌性腹泻小鼠肠黏膜机械屏障的影响 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 试剂与耗材 |
| 4.1.2 实验菌株 |
| 4.1.3 实验动物 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 药物制备 |
| 4.2.2 受试菌培养 |
| 4.2.3 实验分组及给药方案 |
| 4.2.4 实验流程及样品采集 |
| 4.2.5 HE染色 |
| 4.2.6 透射电镜检测 |
| 4.2.7 免疫组织化学检测 |
| 4.2.8 RT-PCR |
| 4.2.9 Western bolt |
| 4.2.10 ELISA法 |
| 4.3 数据处理 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 对大肠杆菌性腹泻小鼠肠道病理损伤的影响 |
| 4.4.2 对大肠杆菌性腹泻小鼠绒毛长度、隐窝深度及其比值的影响 |
| 4.4.3 对大肠杆菌性腹泻小鼠肠道超微结构的影响 |
| 4.4.4 Occludin 免疫组化检测结果 |
| 4.4.5 Claudin-1免疫组化检测结果 |
| 4.4.6 Zo-1 蛋白及基因检测结果 |
| 4.4.7 JAMA检测结果 |
| 4.4.8 MLCK检测结果 |
| 4.4.9 DAO、D-LA、ET检测结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 对小肠形态的影响 |
| 4.5.2 对小肠超微结构的影响 |
| 4.5.3 对紧密连接相关蛋白的影响 |
| 4.5.4 对肠黏膜通透性的影响 |
| 4.6 结论 |
| 5 蒙药BBS复方对大肠杆菌性腹泻小鼠肠黏膜免疫屏障的影响 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 试剂与耗材 |
| 5.1.2 实验菌种 |
| 5.1.3 实验动物 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 蒙药BBS传统复方的制备 |
| 5.2.2 受试菌培养 |
| 5.2.3 实验分组及给药方案 |
| 5.2.4 实验流程及样品采集 |
| 5.2.5 流式细胞术 |
| 5.2.6 流式细胞术(TH1、TH2) |
| 5.2.7 ELISA |
| 5.3 数据处理 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 CD3~+T、CD19~+B细胞百分比检测结果 |
| 5.4.2 CD4~+T、CD8~+T细胞百分比检测结果 |
| 5.4.3 Th_1、Th_2细胞检测结果 |
| 5.4.4 细胞因子检测结果 |
| 5.4.5 免疫球蛋白检测结果 |
| 5.4.6 sIgA检测结果 |
| 5.5 讨论 |
| 5.5.1 对T淋巴细胞及其亚群的影响 |
| 5.5.2 对B淋巴细胞及抗体的影响 |
| 5.5.3 对炎性细胞因子的影响 |
| 5.6 小结 |
| 6 蒙药BBS复方对大肠杆菌性腹泻小鼠肠黏膜化学屏障的影响 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 试验与耗材 |
| 6.1.2 菌种 |
| 6.1.3 实验动物 |
| 6.1.4 主要仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 蒙药BBS传统复方的制备 |
| 6.2.2 受试菌培养 |
| 6.2.3 实验分组及给药方案 |
| 6.2.4 PAS染色 |
| 6.2.5 免疫荧光 |
| 6.2.6 ELISA |
| 6.3 数据处理 |
| 6.4 实验结果 |
| 6.4.1 肠组织杯状细胞检测结果 |
| 6.4.2 MUC-2 的检测结果 |
| 6.4.3 溶菌酶及ITF的检测结果 |
| 6.4.4 二糖酶活力的检测结果 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 总体讨论 |
| 总体结论 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（6）万通筋骨片对类风湿关节炎的抗炎机制研究及16S rDNA高通量测序和代谢组学分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 类风湿关节炎概述 |
| 1.2 类风湿关节炎发病机制 |
| 1.2.1 触发阶段 |
| 1.2.2 成熟阶段 |
| 1.2.3 靶向阶段 |
| 1.2.4 爆发性阶段 |
| 1.3 类风湿性关节炎现代药物疗法 |
| 1.3.1 传统DMARDs |
| 1.3.2 生物DMARDs |
| 1.3.3 小分子DMARDs |
| 1.4 肠道微生物群与类风湿关节炎 |
| 1.4.1 肠道菌群与免疫调节细胞 |
| 1.4.2 肠道菌群介导炎症性关节炎 |
| 1.4.3 肠道菌群介导类风湿关节炎治疗 |
| 1.4.4 益生菌 |
| 1.5 中草药对RA-FLSs细胞凋亡的影响及机制 |
| 1.5.1 RA-FLSs细胞凋亡 |
| 1.5.2 死亡受体介导的凋亡途径 |
| 1.5.3 线粒体依赖性凋亡途径 |
| 1.5.4 .NF-κB介导的凋亡途径 |
| 1.5.5 MAPK介导的凋亡途径 |
| 1.5.6 .其他凋亡途径 |
| 1.6 万通筋骨片研究进展 |
| 1.7 技术路线 |
| 第2章 万通筋骨片在类风湿性关节炎中的抗炎作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验试剂与耗材 |
| 2.2.3 实验细胞与实验动物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 大鼠急毒实验 |
| 2.3.2 CIA大鼠模型建立 |
| 2.3.3 动物分组与给药 |
| 2.3.4 酶联免疫吸附试验 |
| 2.3.5 HE染色 |
| 2.3.6 免疫组化分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 万通筋骨片安全给药浓度 |
| 2.4.2 CIA大鼠模型 |
| 2.4.3 万通筋骨片对RA具有抗炎作用 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 万通筋骨片在类风湿性关节炎中的抗炎机制 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验试剂与耗材 |
| 3.2.3 实验细胞与实验动物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 万通筋骨片溶液配制 |
| 3.3.2 RA-FLSs细胞培养 |
| 3.3.3 细胞形态观察 |
| 3.3.4 RA-FLSs细胞增殖检测 |
| 3.3.5 蛋白免疫印迹分析 |
| 3.3.6 实时荧光定量PCR分析 |
| 3.3.7 细胞免疫荧光 |
| 3.3.8 质粒转染 |
| 3.3.9 Caspase-3/9蛋白酶活性检测 |
| 3.3.10 免疫组化分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 万通筋骨片乙醇提取物对RA-FLSs细胞的影响 |
| 3.4.2 MEK/ERK信号通路介导万通筋骨片的抗炎作用 |
| 3.4.3 万通筋骨片乙醇提取物促进RA-FLSs细胞凋亡 |
| 3.4.4 线粒体依赖性凋亡途径介导万通筋骨片的抗炎作用 |
| 3.5 讨论 |
| 第4章 基于RNA高通量测序挖掘万通筋骨片对RA的抗炎靶点 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验仪器 |
| 4.2.2 实验试剂与耗材 |
| 4.2.3 实验分析软件 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 RA-FLSs细胞培养与分组 |
| 4.3.2 样品收集和准备 |
| 4.3.3 数据分析 |
| 4.3.4 实时荧光定量PCR |
| 4.3.5 蛋白免疫印迹 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 DESeq2差异分析 |
| 4.4.2 差异基因功能注释分析 |
| 4.4.3 KEGG富集通路提取及蛋白互作网络分析 |
| 4.4.4 STEM时间聚类分析 |
| 4.4.5 权重共表达网络分析及功能富集分析 |
| 4.4.6 基因共表达网络分析及蛋白互作网络分析 |
| 4.4.7 核心基因筛选与验证 |
| 4.5 讨论 |
| 第5章 基于16S高通量测序和代谢组学联合分析挖掘万通筋骨片对RA的抗炎靶点 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验仪器 |
| 5.2.2 实验试剂 |
| 5.2.3 实验分析软件 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 16S rDNA扩增子测序 |
| 5.3.2 16S rDNA扩增子信息分析 |
| 5.3.3 代谢物提取 |
| 5.3.4 色谱条件 |
| 5.3.5 质谱条件 |
| 5.3.6 代谢物鉴定 |
| 5.3.7 肠道菌群与代谢物联合分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 万通筋骨片改变CIA大鼠肠道菌群结构 |
| 5.4.2 万通筋骨片作用特定肠道菌群 |
| 5.4.3 万通筋骨片改变CIA大鼠血清代谢物谱 |
| 5.4.4 差异代谢物筛选 |
| 5.4.5 靶点代谢物筛选 |
| 5.4.6 16S rDNA高通量测序与代谢物组学联合分析 |
| 5.5 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 附表 |
（7）缩宫素通过PI3K/AKT信号通路调节树突状细胞功能缓解实验性结肠炎的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词和中文对照 |
| 前言 |
| 第一部分 缩宫素在树突状细胞中的调节作用及其机制 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 附图表 |
| 第二部分 树突状细胞通过缩宫素信号系统在实验性结肠炎中的作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 附表图 |
| 结论与创新 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士在读期间发表论文目录 |
| 外文文献Ⅰ |
| 外文文献Ⅱ |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
（8）自拟“平肠汤”对溃疡性结肠炎（UC）模型大鼠的疗效及作用机制初探（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英汉缩略词对照表 |
| 溃疡性结肠炎治疗研究进展(综述) |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（9）青蒿琥酯通过ERS-UPR信号通路调控溃疡性结肠炎的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 溃疡性结肠炎概述 |
| 1 溃疡性结肠炎的病因和发病机制 |
| 1.1 遗传易感性 |
| 1.2 肠道微生物因素 |
| 1.3 环境因素 |
| 1.4 肠道屏障因素 |
| 1.5 肠道免疫因素 |
| 2 炎症信号通路与UC |
| 2.1 MAPK信号通路 |
| 2.2 JAK/STAT信号通路 |
| 2.3 NF-κB信号通路 |
| 3 UC的治疗方案 |
| 3.1 轻度至中度UC的治疗 |
| 3.2 重度UC的治疗 |
| 第二章 内质网应激信号通路与其在UC中的研究进展 |
| 1 ERS信号通路简述 |
| 1.1 IRE1α-XBP1信号通路 |
| 1.2 PERK-eIF2α-ATF4信号通路 |
| 1.3 ATF6信号通路 |
| 2 ERS信号通路在UC中的研究进展 |
| 2.1 ERS对UC黏膜屏障的调控 |
| 2.2 ERS对UC肠道炎症通路的调控 |
| 2.3 RES对UC肠道免疫细胞的调控 |
| 第三章 青蒿素类药物的研究进展 |
| 1 青蒿素类药物的抗菌作用 |
| 2 青蒿素类药物抗病毒作用 |
| 3 青蒿素类药物的抗肿瘤作用 |
| 4 青蒿素类药物对免疫和炎症调节作用 |
| 5 青蒿素类药物对UC的治疗作用 |
| 本研究的目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第二部分 试验部分 |
| 第一章 青蒿琥酯对DSS诱导小鼠UC的预防保护作用 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要溶剂的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 动物分组与处理 |
| 2.2 小鼠疾病活动指数(DAI) |
| 2.3 结肠组织病理学观察 |
| 2.4 结肠组织超微结构观察 |
| 2.5 免疫荧光检测结肠组织相关蛋白 |
| 2.6 RT-qPCR检测结肠细胞因子的基因表达 |
| 2.7 Western blot检测相关蛋白的表达 |
| 2.8 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 ARS减轻了UC小鼠的症状 |
| 3.2 ARS改善了UC小鼠结肠的病理损伤 |
| 3.3 ARS保护了UC小鼠结肠黏膜层的完整性 |
| 3.4 ARS保护了UC小鼠的结肠粘蛋白 |
| 3.5 ARS保护了UC小鼠结肠的紧密连接 |
| 3.6 ARS抑制了结肠细胞凋亡 |
| 3.7 ARS调控炎性因子基因表达并抑制NF-κB通路的激活 |
| 4. 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第二章 青蒿琥酯对结肠组织ERS信号通路的抑制作用研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要溶剂的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 动物分组与处理 |
| 2.2 小鼠疾病活动指数(DAI) |
| 2.3 结肠组织病理学观察 |
| 2.4 RT-qPCR检测结肠细胞因子的基因表达 |
| 2.5 ELISA法检测细胞因子蛋白表达 |
| 2.6 Western blot检测相关蛋白的表达 |
| 2.7 免疫组化与免疫荧光检测结肠组织相关蛋白 |
| 2.8 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 ARS对DSS诱导结肠组织中ERS的影响 |
| 3.2 ARS选择性地抑制了结肠组织中UPR感应信号通路的激活 |
| 3.3 4-PBA和2-DG对ERS的调控作用 |
| 3.4 4-PBA和2-DG对ERS途径细胞凋亡的调控作用 |
| 3.5 ARS对ERS的抑制作用缓解了结肠炎小鼠的临床和组织学症状 |
| 3.6 ERS参与了ARS对细胞因子和NF-κB的调控 |
| 3.7 ERS参与了ARS对小鼠肠道屏障完整性的保护作用 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第三章 青蒿琥酯对肠上皮细胞ERS的抑制作用研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要溶剂的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞培养与处理 |
| 2.2 CCK-8检测细胞活力 |
| 2.3 SiRNA转染 |
| 2.4 Western blot检测相关蛋白的表达 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 药物对细胞活力的影响 |
| 3.2 Tm诱导IEC-6细胞发生ERS |
| 3.3 Tm对NF-κB信号通路和Claudin-1蛋白的影响 |
| 3.4 ARS缓解了Tm诱导的ERS |
| 3.5 ARS对Tm刺激效应的调控作用 |
| 3.6 SiRNA knockdown对UPR感应信号通路的影响 |
| 3.7 UPR感应信号通路对NF-κB和Claudin-1的调控作用 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第四章 青蒿琥酯在结肠炎治疗中的免疫调控作用 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要溶剂的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 动物分组与处理 |
| 2.2 小鼠疾病活动指数(DAI) |
| 2.3 结肠组织病理学观察 |
| 2.4 流式细胞术检测免疫细胞 |
| 2.5 RT-qPCR检测结肠细胞因子的基因表达 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 ARS治疗对UC小鼠症状的缓解作用 |
| 3.2 ARS对Th17细胞的调控作用 |
| 3.3 ARS对Treg细胞的调控作用 |
| 3.4 ARS对结肠组织中巨噬细胞极化的调控作用 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第五章 青蒿琥酯通过抑制ERS调控肠道免疫 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要溶剂的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 动物分组与处理 |
| 2.2 小鼠疾病活动数(DAI) |
| 2.3 结肠组织病理学观察 |
| 2.4 流式细胞术检测免疫细胞 |
| 2.5 RT-qPCR检测结肠细胞因子的基因表达 |
| 2.6 Western blot检测相关蛋白的表达 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 ARS抑制ERS可缓解DSS诱导的UC症状和病变 |
| 3.2 ERS参与ARS对Th17细胞的调控 |
| 3.3 ERS参与ARS对Treg细胞的调控 |
| 3.4 ERS参与ARS对巨噬细胞极化的调控 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 全文总结 |
| 攻读博土学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（10）CXCLs/ERK/LIF信号通路在癌相关脂肪细胞介导乳腺癌细胞迁移和侵袭中的作用与分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 乳腺癌简介 |
| 1.2 肥胖与乳腺癌 |
| 1.3 脂肪细胞的分化 |
| 1.4 肿瘤微环境与癌相关脂肪细胞 |
| 1.5 LIF与肿瘤 |
| 1.6 ELR+CXC趋化因子与肿瘤 |
| 第2章 脂肪源性LIF对乳腺癌细胞的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 主要试剂材料 |
| 2.1.3 主要细胞、组织 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 主要试剂配置 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 细胞复苏及冻存 |
| 2.2.4 细胞冻存 |
| 2.2.5 人前脂肪细胞原代培养 |
| 2.2.6 体外诱导前脂肪细胞分化 |
| 2.2.7 共培养系统以及细胞培养上清的获取 |
| 2.2.8 RNA的提取、纯度及完整性检测 |
| 2.2.9 RNA逆转录及实时定量PCR(Q-PCR) |
| 2.2.10 Western blot |
| 2.2.11 细胞划痕实验 |
| 2.2.12 Transwell细胞迁移和基质胶侵袭实验 |
| 2.2.13 细胞增殖实验 |
| 2.2.14 酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 2.2.15 RNAi转染 |
| 2.2.16 苏木精-伊红染色(H&E)和免疫组织化学染色(IHC) |
| 2.2.17 流式细胞分析鉴定脂肪细胞表面标志物 |
| 2.2.18 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 前脂肪细胞的鉴定、分化和CAA的形成 |
| 2.3.2 CAA对乳腺癌细胞的作用 |
| 2.3.3 LIF在乳腺癌相关脂肪细胞中高表达 |
| 2.3.4 重组蛋白LIF促进乳腺癌细胞迁移和侵袭 |
| 2.3.5 LIF中和性抗体逆转CAA对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响 |
| 2.3.6 Stattic抑制CAA-CM和 LIF诱导的乳腺癌细胞迁移和侵袭 |
| 2.3.7 靶向Stat3的RNAi抑制CAA-CM和 LIF诱导的乳腺癌细胞迁移和侵袭 |
| 2.3.8 LIF与 IL-6和GM-CSF协同促进乳腺癌细胞迁移和侵袭 |
| 2.3.9 癌旁脂肪组织中 LIF的表达与乳腺癌组织中 Stat3 的磷酸化呈正相关 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 CAA中 LIF高表达的上游信号通路 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要仪器设备 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 主要试剂配制 |
| 3.2.2 Western blot |
| 3.2.3 RNA提取、逆转录、实时定量PCR |
| 3.2.4 免疫荧光 |
| 3.2.5 统计学方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 ERK的抑制剂显着下调CAA中 LIF的表达 |
| 3.3.2 ERK1/2 激活转录因子Stat3和NF-κB上调CAA中 LIF的表达 |
| 3.3.3 免疫荧光检测 CAA 中 Stat3 和 p65 的表达和定位 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 CXCLs激活CAA中 ERK1/2 信号通路上调LIF的表达 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 主要仪器设备 |
| 4.1.2 主要试剂材料 |
| 4.1.3 主要细胞、组织 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 重组蛋白的配制 |
| 4.2.2 抑制剂母液配制 |
| 4.2.3 RNA提取、逆转录、实时定量PCR |
| 4.2.4 Western blot |
| 4.2.5 免疫荧光 |
| 4.2.6 高通量测序(RNA-seq)分析 |
| 4.2.7 酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 4.2.8 统计学方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 CXCLs在与脂肪细胞共培养的乳腺癌细胞中高表达 |
| 4.3.2 乳腺癌细胞通过CXCR2 激活CAA胞内ERK1/2 信号通路并上调LIF的表达 |
| 4.3.3 重组蛋白 CXCL3 和 CXCL8 通过激活 ERK/Stat3/NF-κB 信号通路以上调 LIF 的表达 |
| 4.3.4 CXCL3 的中和性抗体抑制CAA中 LIF的表达及其上游信号通路的激活 |
| 4.3.5 乳腺癌和癌相关脂肪细胞(CAA)高表达CXCLs |
| 4.3.6 LIF上调乳腺癌中CXCLs的表达 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 进一步工作方向 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 LIF在肿瘤微环境中的作用 |
| 参考文献 |
四、Influence of anti-TNFα Monocolonal Antibody on Intestinal Barrier in Rats with Acute Pancreatitis（论文参考文献）
- [1]Xinglou Chengqi Decoction improves neurological function in experimental stroke mice as evidenced by gut microbiota analysis and network pharmacology[J]. GAO Qiang,HAN Zhen-Yun,TIAN Dan-Feng,LIU Gan-Lu,WANG Zhen-Yi,LIN Jing-Feng,CHANG Ze,ZHANG Dan-Dan,XIE Ying-Zhen,SUN Yi-Kun,YAO Xing-Wei,MA Da-Yong. Chinese Journal of Natural Medicines, 2021(12)
- [2]基于转录组学的β-石竹烯抗脑缺血再灌注损伤的机制研究[D]. 刘胜伟. 重庆医科大学, 2021
- [3]松花粉多糖对鸡肠道黏膜免疫的影响及巨噬细胞的免疫调节作用[D]. 沙洲. 山东农业大学, 2021
- [4]氨暴露下肠道菌群在肉鸡呼吸道与肠道炎症的作用机制研究[D]. 周莹. 中国农业科学院, 2021(01)
- [5]蒙药“巴布-7”对大肠杆菌性腹泻小鼠肠黏膜屏障保护机制的相关研究[D]. 高瑞娟. 内蒙古农业大学, 2021(01)
- [6]万通筋骨片对类风湿关节炎的抗炎机制研究及16S rDNA高通量测序和代谢组学分析[D]. 李兆东. 吉林大学, 2021(01)
- [7]缩宫素通过PI3K/AKT信号通路调节树突状细胞功能缓解实验性结肠炎的机制研究[D]. 窦丹丹. 山东大学, 2021(11)
- [8]自拟“平肠汤”对溃疡性结肠炎（UC）模型大鼠的疗效及作用机制初探[D]. 刘梦. 西南医科大学, 2021(01)
- [9]青蒿琥酯通过ERS-UPR信号通路调控溃疡性结肠炎的作用机制研究[D]. 殷韶杰. 扬州大学, 2021
- [10]CXCLs/ERK/LIF信号通路在癌相关脂肪细胞介导乳腺癌细胞迁移和侵袭中的作用与分子机制[D]. 周翀. 南昌大学, 2021(01)